1. 미생물 배지의 준비

미생물 배지의 준비

 

1. 실험 배경과 목적

 

세균배양에 필요한 배지는 배양하고자하는 미생물의 종류에 따라 적합한 것을 선택하여 사용하여야 한다. 따라서 미생물의 종류에 따라 배지의 제법이 다소 달라질 수 있다. 여기서는 배지를 준비할 때 기본적인 주의점과 멸균법 및 평판배지, 사면배지 준비법을 살펴보고, 세균배양에 가장 많이 쓰이는 영양배지의 제법을 실습하도록 한다.

 

1) 배양배지의 준비

 

배지를 만들 때는 그 조성에 따라 필요한 내용물을 저울 등으로 담아 용기에 담고 혼합하여 물을 가한 후 멸균하는데, 세균배양에 필요한 다양한 배지들이 조성대로 이미 만들어져 탈수시킨 상태(dehydracted media)로 시판되는 종류도 많다. 탈수배지는 정해진 농도로 물을 가한 후, 멸균하여 사용하면 된다. 일반적으로 배지를 만들 때는 다음 사항을 지켜야 한다.

 

① 배지를 담을 유리용기는 가능하면 깨끗한 것으로 경질유리제품 (pyrex)을 이용한다. ② 특별히 언급한 경우가 아니면 증류수를 사용한다.

③ 배지 내용물을 정확히 달아 언급한 순서대로 첨가한다.

배지의 pH는 미생물의 생장 에 의해 변화된다. 따라서 필요할 경우 배지 준비시 pH측정기나 pH 지시종이로 재고 지정한대로 배지의 pH를 맟추도록 한다. 대개의 배지는 그 구성성분이 완충능을 갖도록 되어있으나, 필요한 경우 제조시 산이나 알칼리를 첨가하여 pH를 보정해 주어야 한다.

④ 물에 녹인 배지는 특별히 불용성 물질이 함유된 경우를 제외하고는 맑아야하며, 배지 가 맑아야만 접종 후 균체의 생장여부를 쉽게 판독할 수 있다. 따라서, 배지를 맑게 하기 위해서는 여과지 등으로 직접 여과시키거나, 계란의 흰자(egg white)를 가한 후 가열하면 녹지 않은 입자들이 계란 흰자와 함께 응어리로 뭉쳐지는데, 이를 여과하여 맑게 만들기도 한다. 여과시 배지의 양이 적은 것은 여과지로 (Whatman No. 1) 거르 고, 양이 많을 경우에는 두꺼운 펼프층이나, 목화솜 등을 Buchner funnel에 진공펌프 를 이용하여 여과시키도록 한다. 이런 연후에 구멍크기가 작은 여과지로 걸러 모든 현탁입자를 제거시킨다.

⑤ 배양배지는 멸균 전에 사용하기 편리한 양만큼 솜마개, 금속마개 또는 나선형 뚜껑이 덮힌 시험관이나 플라스크에 나누어 담는다.

 

2) 배지 멸균시의 일반적인 유의사항

 

배지는 일반적으로 고압증기멸균기(autoclave)를 사용하여 121℃(101.3kpa 또는 15 p.s.i)에서 15분정도 멸균하나 멸균시간은 용기의 종류나 배지의 양에 따라 다르다. 멸균시간은 정확히 측정하여 결정하도록 한다. 왜냐하면 너무 가열되면 대부분의 배지성분이 손상되기 때문이다. 또한 배지 멸균시 솜마게는 종이나 알루미늄 박으로 싸서 너무 젖지 않도록 하고, 나선형 뚜껑등은 약간 느슨하게 닫아서 가열에 의한 팽창 때문에 깨지지 않도록 하고, 멸균후에 꺼내어 꽉 잠그도록 한다.

열에 약한 배지 (또는 배지 성분)는 여과하거나 변형된 열처리법으로 멸균하되 초기에 배지를 만들 때 오염되지 않도록 무균조작에 신경쓰도록 한다. 주로 열에 약한 성분은 여과하고, 열에 안정한 성분은 별도로 습윤멸균한 후 무균적으로 둘을 섞어 사용한다.

 

3) 탄수화물의 멸균과정

 

일반적으로 가능하면 고농도의 용액을 여과하여 사용한다. 탄수화물의 종류에 따라 다음의 방법으로도 멸균가능하다.

① Tydalization : 하루간격으로 3일동안 100℃에서 30분간 끓인다. 주로 adonitol, arabinose, inositol, raffinose, rhamnose, sorbitol, trehalose.

② 35kpa(약 5.2 p.s.i)에서 25분간 습윤멸균 : aesculin, fructose, glucose, glycerol, lactose, mannitol, salicin, sucrose 등

③ 여과법으로만 사용할 것 : inulin, maltose, xylose.

 

열에 안정한 배지성분은 모두 물에 녹여 따로 습윤멸균한 후, 위와 같이 따로 멸균한 탄수화물을 무균적으로 첨가한다. 이 경우 곧바로 사용하지 말고 37℃에서 하루밤 방치하여 멸균여부를 확인한후 사용하도록 하고, 특정당의 이용하는데 사용하고자 할 때는 그 배지에서 확실히 생장하는 것으로 알려진 표준 균주를 배양했을 대 양성반응이 나타나는지 확인한 후에 사용하도록 함이 현명하다.

 

④ 보관법 : 나선뚜껑 시험관에 든 배지는 직사광선을 피하여 상온에서 보관한다. 이 용기는 배지의 증발을 방지하여 보관시 배지의 건조를 방지하는 이점이 있다. 솜마개 또는 금속마개를 한 시험관이나 플라스크는 4℃에 보관하도록 한다.

 

4) 고체 평판 및 사면배지의 준비법

 

고체배지는 다량준비하여 멸균하고 (미리 멸균하여 둔 것은 사용직전에 고압증기 처리하거나 끓여서 녹이고) 50℃로 식힌 후, 열에 약한 혈액, 항생제, 당, 아미노산등은 역시 45℃정도로 맞추어 첨가하되 거품이 일지 않도록 용기를 조심스럽게 흔들어 혼합한다. 그런 다음 멸균된 페트리 접시나 용기에 나누어 붓는다.

 

① 페트리접시에 붓는 법 : 멸균된 페트리 접시를 바닥이 평평한 곳에 준비해 두고 45～50℃로 식힌 배지가 든 플라스크의 입구를 불꽃으로 살균한 다음, 페트리접시의 뚜껑을 열고 15㎖ 정도씩 붓는다. 이때 오염이 되지 않도록 주의하고 배지를 부은 페트리접시는 배지가 굳을 때까지 움직이지 않도록 한다. 굳은 고체 평판배지는 비닐막 등으로 잘 싸서 4℃에 보관하도록 하며, 사용 전에 잘 말려서 사용하도록 한다. 한천배지의 표면에 물기가 있으면 콜로니가 명확히 구분되지 않게 되어 단일 콜로니의 선별이 어렵다. 4℃에서 며칠간 보관한 경우는 건조시간이 단축되거나, 따로 건조시킬 필요가 없는데, 필요할 경우 37℃에서 하룻밤 방치하여 배지를 말리도록 한다. 이 과정은 건조와 동시에 배지의 오염여부를 확인할 수 있는 장점이 있다.

 

② 사면배지 준비법 : 물에 녹인 배지를 중탕하여 잘 녹인 후 약 5㎖씩 (시험관의 크기에 따라 양을 조절한다) 나누어 담고 마개한 후, 습윤멸균한다. 멸균이 끝난 후 배지를 비스듬히 기울여(30-40도 정도) 굳힌다. 이 때 사면배지가 너무 경사지거나 배지량이 많아서 시험관 입구 가까이에 도달하지 않도록 주의한다. 대개 시험관의 ½정도로 한다. 필요에 따라 접종침을 찔러 접종할 경우에는 약 7㎖의 배지를 붓고 바로 세워서 굳히도록 한다. 사면배지 역시 4℃에서 보관하도록 한다.

2. 실험 재료 및 방법

 

▣ 재 료

한천(agar), 효모추출물(yeast extract), tryptone, NaCl,

2ℓ짜리 삼각플라스크 혹은 비이커,

500㎖짜리 삼각플라스크, 500㎖짜리 눈금 실린더,

솜, 마개,

pH측정기, 저울, 1N HCl, 1N NaOH, 멸균기

시약용 숟갈, 유산지, 증류수가 들어 있는 비이커 (또는 세척병)

 

▣ 과 정

① 2ℓ플라스크에 증류수 500㎖을 붓는다.

 

② tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g 을 플라스크에 달아 넣는다. 이때 유산지 를 천칭위에 올려놓고, 증류수로 잘 씻은 시약용 숟갈을 휴지로 닦아 물기를 완전히 제거하여, 시약을 달도록 한다. 한 시약을 달고 난 후 에는 숟갈을 꼭 세척하도록 하 며, 부주의하여 시약통의 시약이 다른 시약에 의해 오염되지 않도록 주의한다. 또한 천칭에 시약을 흘리지 않도록 주의하며, 흘린 경우에는 즉시 닦아내도록 한다.

 

③ 플라스크를 잘 흔들어 내용물을 다 녹인다. 증류수를 가하여 전체량이 1ℓ가 되도록 한다.

 

④ 위 용액을 500㎖ 플라스크에 250㎖씩 나누어 담고 다음과 같이 한다. 첫 번째 배지에는 더 이상 배지성분을 첨가하지 않고 액체배지로 사용하고, 두 번째 배지에는 한천 3.75g (고체배지를 만들 때는 한천을 배지 1 리터당 15g을 첨가)을 가하고 흔들 어준 다음, 5분쯤후에 중탕하여 녹이되, 가끔 흔들어 준다. 이렇게 만든 것이 영양한 천배지이다.

 

⑤ 위의 네 가지 배지를 pH측정기(또는 pH 측정용종이)로 1N HCl이나 1N NaOH를 가 하여 pH 7.0 으로 맞춘다. 사용 후 pH 전극(electrode)은 잘 세척한다.

 

⑥ 시험관에 각각 나누어 담고 마개를 한 후 습윤멸균을 121℃(15 p.s.i)에서 15～20분 멸균한다.

 

⑦ 멸균이 끝나면 사면배지 만들어 놓은 것은 기울여 눕혀 사면배지를 만들고, 식혀서 4℃에 보관한다.

 

3. 실험수행상 주의 할 점

영양배지 등 영양소가 풍부한 배지에 포도당을 첨가할 때는 일반적으로 다른 배지성분과 함께 녹여 습윤멸균 하기도하며, 멸균시간을 10분 내외로 단축하기도 한다. 그러나 생장율 측정또는 생리적 특성 조사용 배지를 만들 때는 앞서 살펴본 바와 같이 여과하여 멸균한 높은 농도의 포도당 저장용액을 만들어두고 50℃정도로 식힌 배지에 첨가하도록 한다.