3. 흡광도를 이용한 세균의 성장곡선 측정

흡광도를 이용한 세균의 성장곡선 측정

 

1. 실험 목적

세균을 액체배지에 배양할 때 성장곡선을 측정하기 위하여 평판배지에서 콜로니숫자를 측정하는 콜로니계수법으로 세균의 숫자를 측정한다. 대량 배양할 때나 실험하는 샘플의 숫자가 많은 경우에는 배양액의 흡광도를 측정함으로써 세균의 생장을 측정할 수 있다. 이번 실험에서는 배양액에서 세균의 생장곡선을 흡광도 측정방법으로 조사한다.

 

2. 실험 원리

이 방법은 세균의 배양액에 일정한 파장의 빛을 통과시켰을 때 용액은 그 빛을 흡수 또는 산란시킬 수 있고 이 때 흡수된 빛의 양은 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 것이다. <그림1>은 흡광도계에서의 빛의 경로를 표시한 것이다. 전구에서 나온 백색광은 회절격자(Diffraction grating)에 의해서 일정한 파장 순서의 스펙트럼으로 배열되므로 파장조절장치를 이용하여 우리가 원하는 단일파장의 빛을 시료에 투사시킬 수 있다. 시료를 투사한 빛은 광전관(Phototube)을 거쳐서 검류계(Galvanometer)에 백분율로 표시할 수 있게 된다. 이때 투과된 빛의 양은 시료의 균체수에 반비례하게 된다. 따라서 여러 가지 비율로 희석된 배양액의 흡광도(Optical Density, OD)를 잰 다음 각 흡광도에서의 정확한 세표수를 알아내어 이들의 상관관계를 구해놓으면 흡광도 측정만으로도 미지의 균체수를 알아낼 수 있다.

 

 

3. 실험 재료 및 방법

▣ 재 료

․균주 : Escherichia coli 배양액(6시간 이상 배양)

․배지 : LB broth 배지, LB agar 배지(LB broth 배지에 Agar 15g/ℓ첨가)

․기구 및 시약 :분광 광도계,

무균대, 멸균된 피펫, 멸균된 희석용 시험관, 멸균된 증류수

 

▣ 과 정

(1) 멸균된 상태의 배지 100㎖에 E. coli 배양액 1㎖을 접종하여 키운다. (37℃, 200 rpm)

(2) 접종 후 4시간동안 0 time을 포함하여 매 30분마다 시료를 무균조작 방법으로 채취하여 다음과 같이 흡광도 측정을 수행한다. 시간별로 시료를 채취하여 흡광도(파장은 595nm 또는 600nm)를 잰다. 0 time에서의 OD600은 0.08～0.1로 출발하는 것이 적당하다. 배양시간에 따른 흡광도의 변화를 그래프용지를 사용하여 그려보고 이로부터 대수기에서의 Generation time을 간접적으로 구해본다. Generation time은 흠광도의 변화가 2배로 될 때까지 걸리는 시간이다.

4. 실험수행상 주의 할 점

(1) 시간별로 시료를 채취할 때 무균조작 하도록 하고 채취가 끝난 배지는 바로 배양 기에 넣어 시간을 지체하지 않도록 한다.

(2) 분광광도계(Spectrophotometer)를 사용할 때는 충분히 예열을 해야 하며 반드시 멸균된 동일 배지로 0점 조정을 한 후 사용한다.

 

5. 고찰

(1) 배양시간에 따라 세균의 변화를 반대수(Semi-log) 그래프 용지에 그려보고 Generation time(GT)을 직접 구해본다.

GT = t log2/ (logA-logB)

여기서 B = 대수생장기에서 한 시점에서의 세균수

A = 대수생장기에서 두번째 시점에서의 세균수

t = A, B 두 지점사이의 시간

 

(2) 흡광도 측정 및 콜로니 계수법의 두 가지 방법으로 구한 Generation time을 비교해보고, 또 대수기에서의 흡광도와 균체수의 상관관계를 알아보자. (E. coli에서는 OD600 = 1일때 약 0.8 x 109 cells/ml을 나타낸다.)