2. 세균 수 측정(Bacterial Population Count) _정량평판법

세균 수 측정(Bacterial Population Count)

 

1. 실험의 배경과 목적

 

일정한 체적의 물질 내에 세균이 얼마나 오염되어 있는가를 알아보는 방법에는 여러 가지가 있다. 예컨대 우유에 오염된 세균수를 알아보려면 일정량의 우유를 슬라이드에 도말하여 현미경으로 직접 세어보거나, 혈구 계산에 흔히 쓰이는 혈구계수기(hemacytometer)로써 세균수를 세어 전체 용적의 세균수를 계산하는 방법도 있다. 그러나 위와 같은 방법은 표본에 세균수가 비교적 적은 경우에 적용하는 방법들인 것이다. 본 실험에서는 폐수, 우유, 식료품 등 어떠한 물질이든 간에 세균수 측정에 흔히 사용하는 두가지 방법에 대하여 자세히 알아 보기로 하자.

 

2. 실험재료 및 방법

 

1) 정량 평판법(Quantitative plating Method, Standard Plate Count)

표준 평판법(S.C.P)라고도 하며 그림 1 처럼 일정량의 멸균수를 주입한 희석병에 표본을 일정한 비율로 희석하여 한천배지의 평판에 접종하는 방법이다.

그림 1과 같이 샘플에서 1㎖을 취하여 멸균수 99㎖이 든 희석병 A에 접종하면 표본 원액은 100배로 희석된 셈이다. A 희석병에 1㎖을 정확히 따서 B의 99 ml에 접종하면 10,000배로 희석되며, 그와 같은 방법을 희석병 C에 적용하면 1,000,000배 희석된 셈이다. 그런데 표본 원액에 세균이 얼마나 존재하는지를 알지 못하므로 희석병 B와 C로부터 각각 0.1㎖와 1.0㎖씩 희석된 표본액을 따서 한천배지의 평판에 접종시키게 된다. 왜냐하면 희석병에서는 균체수가 지나치게 희석되므로 인하여 한천평판위에 콜로니를 형성치 못할 경우가 있을 것이며 또 어떤 경우는 희석병 B의 경우에도 균체수가 아직도 너무 많이 존재할 경우도 있을 것이므로 적어도 B와 C의 희석병에서 희석수를 따서 접종함으로써 실험결과를 상호 보완할 수 있을 것이다.

▣ 재 료

E.coli의 액체배양체,

nutrient agar,

멸균된 페트리 접시 다수, 멸균된 피펫 다수,

99㎖의 멸균수를 담은 마개달린 희석병(dilution blank)3개

 

▣ 과 정

① nutrient agar를 액화하여 50℃ 정도로 식히고 항온수조에 넣고 99㎖의 멸균수가 긴

희석병에 각각 A,B,C로 표시하고, 또한 멸균된 페트리 접시의 밑바닥에

1:10,000 , 1: 100,000 , 1: 1,000,000 및 1:10,000,000으로 표시하여 놓는다.

② E.coli의 배양체를 잘 흔들어 멸균된 1.1㎖피펫으로 1㎖의 세균용액을 따서 희석병에

접종한다.

③ 희석병 A를 마개를 닫은 채로 25회 정도로 흔들어서 균체덩어리를 분리되게 한다.

④ 멸균 피펫으로(1.1㎖)희석병 A에서 1㎖을 취하여 희석병 B에 접종하고 25회 흔들어

준 후 역시 동일한 과정을 거쳐서 희석병 B와 C에 접종한다.

⑤ 희석병 B를 25회 흔들고 멸균 피펫으로 1㎖을 취하여 1:10,000으로 표시한 페트리

접시에 0.1㎖을 취하여 1:100,000으로 표시한 페트리 접시에, 0.1㎖을 취해 1:10,000,000의 페트리 접시에 접종한다.

⑥ 50℃의 nutrient agar 배지를 이미 표시해 놓은 페트리 접시에 주입하고 조심스럽게

흔들어 주어서 배지와 접종 세균이 잘 섞이도록 해 준다.

⑦ 배지가 완전히 굳으면 35℃의 항온기에 페트리 접시를 거꾸로 넣어서 48시간 배양한

다.

 

 

*세균수의 측정과 계산

 

colony counter를 사용하면 측정에 편리하나 이러한 기구가 없으면 마커펜으로 페

트리 접시의 앞 또는 뒷면을 4분원체, 콜로니가 너무 많으면 8분원체로 금을 그어 놓고 해

부 현미경을 통하여 관찰할 수도 있다.

 

① 48시간 배양한 페트리 접시를 꺼내어 희석된 순서대로 놓고 비교하여 본다. 그리고 나타난 콜로니의 수가 30보다는 많고 300보다는 적은 것이 어느 것인가를 대략 확인해 보라.

30이하 또는 300이상의 콜로니를 가지는 페트리 접시는 세균수 측정에 오류가 생길 가능성이 많다.

② 적당한 페트리 접시를 Quebec콜로니 계수기에 올려 놓고 확대경을 통하여 크고 작은 모든 콜로니를 계수기를 가지고 셈한다.

③ 콜로니의 수를 1㎖당 세균수로 계산한다. 즉, 1:1,000,000배로 희석하여 접종한 페트리 접시에서 220개의 콜로니를 측정했다면,

220 × 1,000,000= 220,000,000 세균/1㎖

으로 계산할 수 있다. 단 2개의 유리수를 사용함이 바람직하다. 예컨대 227 개의 콜로니를 측정했다면 230,000,000 세균/1㎖로 표시하는 것이다.

2) 탁도 측정법(Turbidimeteric Determination)

 

세균수를 측정해야 할 표본이 과다할 경우에 정량 평판법을 통하여 측정하는 것은

여러 모로 힘든 경우가 많다. 예컨대 수많은 유리 기구라든가, 상당량의 배지, 이에 따르는

세척, 준비 등 시간적으로도 감당하기 어려운 경우가 있으므로 흔히 표본의 세균들을 배양

하여 배양액의 탁도(turbidity)를 측정하는 방법을 택하고 있다. 탁도를 측정하는 것은 흔히

흡광도(spectrophotometer)를 사용하는데 이는 세균배양액 내에서 세균들이 마치 교질용액

의 적은 입자처럼 존재하면서 어느 범위내의 광선을 흡수하는 원리를 응용하고 있다. 즉 세

균 배양액의 농도에 따라서 광흡수는 비례함을 나타내 주고 있다. 그러나 균체의 탁도를 세

균수로 확인하기 위해서는 흔히 표준 평판법을 병행하여 사용하기도 한다.

 

 

실험보고서 A. 정량평판법

 

1. 어느 plate가 측정하기 좋도록 희석이 되었는가?

2. 그 곳에는 어느 정도의 콜로니가 있었는가?

3. 배양시 1㎖당 얼마나 많은 균이 존재했는가?