5-1. Plasmid Preparation

Plasmid Preparation

 

Introduction

Alkali lysis method 의 원리 / Solution I, Solution II, Solution III

Supercoiled(closed circular) DNA와 open circular DNA

DNA precipitation(ethanol) / Biophotometer

 

I. Goal

DNA preparation 과정을 구분하여 이해하고 원리를 설명할 수 있다.

 

II. Materials

Cell,

Solution I,

Solution II,

Solution III,

phenol:chloroform(1:1),

100% ethanol,

SDW, ice,

LA(LB+Ampicillin) plate,

 

III. Procedure

1. 항생제가 첨가된 plate에 자란 colony를 백금선 루프로 한 개 따서 동일한 항생제가

2. 3 μl가 첨가된 LA배지에 seeding하여 37°C incubator에서 12-16시간 배양한다.

3. 10시간 이상 배양한 cell 1.5ml를 eppendrof tube로 옮겨 14,000rpm에서30sec - 1min하거나 15ml culture tube 일경우3,000rpm에서 15-20min

4. 상층액을 버리고, cell pellet에 Solution I를 100 μl 넣고 vortexing 하여 완전히 녹인다.

5. Solution II를 200 μl첨가한 후, tube를 inverting 하여 조심스럽게(5-6회) 섞어준다.

6. Solution III를 150μl 첨가하여 inverting하여 섞어준다.

7. ice에 5min간 놓아둔다.

8. 4°C, 15,000rpm으로 5min centrifuge한 후 상층액을 new eppendrof tube에 옮기고 남아있는 protein을 제거하기 위해 phenol:chloroform(1:1)을 상층액과 동일한 부피로 섞어서 10-15sec vortexing 후 Max.rpm에centrufuge한다.

9. centrifuge한 tube의 상층액을 new tube에 옮긴 후 2-2.5volume의 100% ethanol를 첨가한 후 흔들어준다.

10. 4°C, Max.rpm에centrifuge 10-15min 하면 yellowish white pellet이 생성된다.

11. ethanol을 pellet에 영향을 주지 않고 제거한 후에 spin-down 시키고 상온에서 건조시킨다.

12. 생성된 pellet의 양에 따라 적량의 SDW로 녹인다.

13. miniprep 한DNA 1μl + SDW 49μl로 dilution 시킨 후에 DNA concentration를 Biophotometer로 측정한다.

IV. Results

chromosomal DNA와 plasmid DNA의 분리 과정을 설명할 수 있다.