5-2. Plasmid DNA의 분리 및 정제방법

Plasmid DNA의 분리 및 정제방법

 

플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chromosomal DNA 로부터 분리하여야 한다. 플라스미드 분리방법은 플라스미드 DNA와 bacterial DNA의 물리적인 차이점에 의해 분리된다. 가장 큰 플라스미드의 길이는 E. coli 의 염색체 길이에 8%밖에 되지 않으며 대부분이 작다.

플라스미드와 bacteria DNA의 구조에 차이로부터 분리하는 방법이 있다. 플라스미드와 염색체는 구형인데 염색체는 extract 시 구형에서 선형조각으로 깨어지며 플라스미드에는 구형으로써 변화가 없다. 이 구조적인 차이점을 이용하여 정제된 플라스미드를 얻을 수 있다.

 

<분리방법> :Minipreps of plasmid DNA

bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법은 대단히 많지만

성공률과 속도를 생각하여 세 가지 방법으로 소개하면

Alkaline lysis prep, boiling method 그리고 lithium-based procedure 이다.

 

① Alkaline lysis miniprep

 

alkaline lysis procedure(Bimboim, Doly, 1979)은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다(여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다). 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며(SDS는 potassium과 화합물을 이룬다) 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.

 

A. Materials

1.Soln.1 (lysis soln)-autoclave

100ml preparation

50mM Glucose 0.9g

10mM EDTA(pH 8.0) 2ml 0.5M EDTA

25mM Tris.cl(pH 8.0) 25ml 0.1M Tris.cl

D.W Up to 100ml

 

2.Soln.2 (NaOH/SDS soln)-autoclave, Fersh soln only

20ml preparation

0.2N NaOH 0.16g NaOH

1w/v% SDS 0.2 g SDS

D.W Up to 20ml

Store at r.t,if white granules detected MUST discard!

cf) Quick preparation

Autoclaved 2g/50ml (1N) NaOH 4ml -+

Autoclaved 10w/v% SDS 2ml -+ 40℃에서 녹여서 사용

Autoclaved D.W 16ml -+

3.soln.3 -M(KOAc 3M,pH 4.8)-autoclave

100ml preparation

5M KOAc (94.15g/200ml D.W) 60ml

Glacial HOAc 11.5ml

D.W 28.5ml

 

4. RNase solution

20mg pancreatic RNase/ml in 10mM Tris HCl(pH 7.5), 15mM NaCl

Heat at 100'C for 15min, and store at -20℃

 

5. TE buffer

10mM Tris HCl(pH 8.0)

1mM EDTA(pH 8.0)

 

B. Procedure

 

1 .Grow cell culture in L broth + Ampicillin(100ug/ml final conc.)overnight.

2. Take 1.0ml cell suspention into 1.5msl Eppendorf tube.Centrifuge 15 seconds in 10,000×g

3. Remove supernatant carefully with fine aspirator

4. Lysis soln. preparation ; 4mg lysozyme/ml soln.1

5. Add 100ul Lysis soln. to suspend the pellet and hold at r.t 5min.

cf) 만일 cell culture 가 없고 plate에 긁어 놓은 것이 있으면 이쑤시게를 이용 좁쌀크기로 떠내서 바로 soln.1을 넣은 tube에 넣고 가볍게 vortexing을 실시하여 suspention시킨 것을 이용한다.

6. Add 200ul NaOH/SDS reagent(soln.2) mix and hold on ice bed 5min.

soln.2가 들어가면 투명하게 되며 점도가 높은 것이 ice-bed에 두면 점성이 낮아진다.

7. Add 150ul of KOAc(pH4.8,Soln.3-M),flicking,and store the tube on ice bed 5min.

soln.3가 들어가면 하얗게 되며 ice bed에 두면 점도가 낮아지고

liquid phase와 protein/gDNA phase가 구분되어진다.

8. Add 400ul of PCI(25:24:1),mix and centrifuge 5min.at 15℃

9. Transfer the supernatent to a fresh tube,

Add 500ul 100% EtOH,vortex 10sec, and stay for 5min. at r.t.

10. Centrifuge 5min.at 15oC and discard the supernatent

11. Drain off the EtOH completely and vacuum pump drying 15min.

12. Resuspention the pellet with 20ug/ml RNase contained 43ul D.W or TE buffer.

 

 

② Boiling miniprep

 

Plasmid를 지닌 bacteria는 lysozyme, Triton(a nonionic detergent), 열처리 등으로 깨어질수 있다. chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을 수 있으며 plasmid DNA는 상등액에서 isopropanol(Holmes and Quigley,1981)로 침전시켜 분리할 수 있다. boiling miniprep는 적은 양의 plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만 분리된 plasmid DNA는 alkaline lysis miniprep 보다 quality가 떨어진다.

 

A. Material

LB medium(적합한 항생제가 첨가된 배지)

STET soln.

Hen egg white lysozyme

Isopropanol, ice-cold

TE buffer

10 mg/ml DNase-free RNase

1.5-ml microcentrifuge tubes

Boiling water bath(100℃)

B. Procedure

 

1. 단일콜로니를 5ml 멸균된 LB medium에서 overnight 한다

(37℃에서 최소한 mid-log phase 까지 배양한다).

2. 1.5ml의 종배양액을 1.5ml microcentrifuge tube에 옮기고 원심분리하여 cells을 모은다 (pellet). 상등액을 제거한다.

3. 200㎍ lysozyme이 든 STET soln. 300㎕에 pellet을 녹인다.

4. 30s∼10min정도 얼음물에다 tube를 정치한다.

5. boiling water bath(100℃)에 1∼2 min 정도 tube를 정치한다.

6. 15∼30min정도 원심분리한다.

7. pipet으로 상등액을 새로운 tube에 옮긴다(이때 pellet에 주의하여 옮긴다).

200㎕(상등 액과 같은 양) cold isopropanol에 섞는다.

-20℃에서 15∼30 min 정도 정치한다. 다시 5 min 정도 원심분리한다.

8. 상등액을 제거하고 pellet이 마를 때 까지 진공상태로 정치한다.

9. 50㎕ TE buffer에 pellet을 녹여 보관한다.

 

 

 

③ Lithium miniprep

 

Plasmid DNA는 평판 또는 액체배지에서 배양되는 E.coli로부터 획득할 수 있는데, Bacterial cells은 Triton X-100/LiCl과 phenol/chloroform을 처리하여야만 한다. 이것은 plasmid DNA의 가용성화와 chromosomal DNA, cellular debris등에 침전을 일으킨다. debris는 원심분리를 통해 제거할 수 있다. 이러한 분리절차로 chromosomal DNA 등을 제외한 plasmid DNA만을 얻을 수 있다.

이번 분리방법은 가장 빠르게 plasmid DNA를 분리하는 방법이며 대부분의 생물학적 적용면에 이용할 수 있는 정제된 plasmid DNA를 분리할 수 있다.

 

A. Materials

 

TELT soln.

LB medium(항생제첨가배지)

1:1(w/v) phenol/chloroform

100% ethanol(-20℃보관)

TE buffer

10mg/ml DNase-free RNase A

1.5ml microcentrifuge tubes

 

 

B. Procedure

 

1. 형질전환체 colonies로부터 plasmid DNA를 분리하기 위해 다음과 같이 세포를 준비.

a. microspatula를 이용하여 LB agar plate에 있는 bacterial colony(2∼5mm diameter까지 배양된 colony)을 떼어 100㎕ TELT soln.이 들어있는 1.5-ml microcentrifuge tube에 옮긴다.

 

b. step 3의 과정을 위해 위의 혼합액을 Vortex하여둔다.

2. 액체배지로부터 plasmid DNA를 분리하기위하여 다음과 같이 세포를 준비하여둔다.

a. 적합한 항생제가 첨가된 1.8ml LB medium에 bacteria colony를 배양한다

(대략 30℃, 18∼24hr까지 진탕배양).

b. 신중히 배양액을 1.5-ml microcentrifuge tube에 옮긴다.

c. 세포를 원심분리(10,000×g, for 20sec)하여 pellet을 형성시킨다.

d. tube를 수직상태로 들고 상등액을 aspirator로 제거한다.

e. 100㎕ TELT soln.을 pellet에 넣고 vortex로 녹인다.

 

3. 100㎕ 1:1 phenol/chloroform을 첨가하고 5sec 정도 vortex를 한다.

4. 원심분리(15,000×g, for 1min)를 한다.

5. pipettor를 이용하여 신중히 75㎕ upper aqueous phase를 빼내어 새로운 microcentrifuge tube에 옮긴다.

6. 상등액에 150㎕ 100% ethanol(chilled)를 첨가, plasmid DNA가 침전될 수 있도록 섞는다.

7. 원심분리(for 5min)하여 pellet을 형성시킨다.

8. 상등액을 제거한다.

9. 1ml cold 100% ethanol로 씻어주고 step 6과 7을 반복하여 nucleic acid pellet을 회수 한다.

10. tube를 cap으로 닫고 cap에 작은 구멍을 낸다. vacuum dessicator에 tube 위치시켜 놓 는다. nucleic acid pellet이 완벽하게 마를때까지 진공상태를 유지한다.

11. 30㎕ TE buffer에 녹인다.

 

 

 

 

 

 

<정제방법>

 

1. CsCl/Ethidium Bromide Equilibrium Centrifugation에 의한 plasmid DNA 정제

 

이 방법은 대부분의 contaminants로부터 정제도가 높은 plasmid DNA 얻을 수 있다. 그러나 ethidium bromide의 사용과 밀도구배를 위해, 많은 시간이 걸리는 초원심분리가 필요하다.

 

 

A. Material

 

TE buffer

Cesium chloride

10mg/ml ethidium bromide

CsCl/TE Soln.

Dowex AG50W-X8 cation exchange resin

TE buffer/0.2M NaCl

100% and 70% ethanol

Beckman VTi65 or VTi80 rotor(or equivalent)

5ml quick-seal ultracentrifuge tube

3ml syringes with 20-G needles

B. Procedure

 

1. 4ml TE buffer 로 crude lysate prep.의 마지막 스텝에서 얻어진 pellet을 녹인다.

또한 4.4g CsCl 첨가하여 용해시키고 10mg/ml ethidium bromide의 0.4ml를 가한다.

<주의할점>

Ethidium bromide는 돌연변이원이며 환경에 매우 위험한 물질이므로 이용시 신중하게 해야하며 장갑을 끼고 실험을 하도록 한다.

ethidium bromide는 용액에 남아있는 단백질과 화합물을 이루어 진한 적생을 형성하여 침전된다. 이 침전물은 lysate-CsCl/ethidium bromide 용액을 실온, ∼2000×g로 원심분리 하여 제거할 수 있다.

이 절차 후에는 protein/ethidium bromide complex는 용액의 상위 부위에 하나의 disc를 형성한다. 용액을 pipett을 이용하여 disc 아래부위만을 뽑아낸다.

 

2. 5-ml ultracentrifuge tube에 용액을 옮긴다. 필요시 CsCl/TE 용액으로 채우고 밀봉한 다. 원심분리(3.5hr at 20℃, 500,000×g 또는 14hr at 350,000×g)에서 원심분리하여 plasmid band를 형성시킨다.

*이 step은 매우 중요한 부분으로 원심분리 시 온도가 15℃ 이하에서 시행하여야 한 다. 구배를 하기 위해서 고농도의 cesium chloride와 높은 원심력이 필요하기 때문이며 낮은 온도에서 시행m시 cesium chloride가 tube 바닥으로 침전이 된다.

 

3. 20-G needle을 tube의 상위부분에 조심스럽게 삽입하고 3-ml syringe과 다른 20-G needle결합시켜 plasmid band의 ∼ 1cm 아랫부위에 주입시켜 plasmid band를 흡입한다.

 

4. 만약 고도로 정제된 plasmid DNA를 얻기 위해서라면 두 번째 ultracentrifuge를 시행하 여 RNA와 chromosomal DNA를 제거한다.

 

5. 유리 또는 플라스틱 column에 plasmid DNA/ethidium bromide용액 부피의 1.5∼2배 정도 의 Dowex AG50W-X8 column을 채운다.

그것을 wash과 평형을 위해 TE buffer/0.2 M NaCl 를 column에 흘려보낸다.

 

6. resin을 건들지 않고 그 위에 직접적으로 plasmid DNA/ethidium bromide용액을 채운다.

 

7. loading 후 직접적으로 column으로부터 흘러 나오는 용액을 수집하기 시작한다. volume laded의 두배가 되는 TE buffer/0.2M NaCl을 column에 흘려보낸다.

plasmid DNA는 resin을 통해 흘러 나오고 ethidium bromide는 resin에 남아 있게 된다 (윗부분은 적색을 띤다).

 

8. 2vol의 100% ethanol(-20℃보관)를 plasmid DNA에 가하여 원심분리(10min 4℃, 10,000×g).

<주의 할점>

이 용액은 -20℃이하가 되면 안되는데 : cesium chloride가 침전되기 때문이다.

 

9. 70% ethanol로 wash 후 vacuum상태에서 건조시킨다. TE buffer로 pellet을 녹이고 4℃에 서 보관한다.

2. PEG Precipitation

 

이 방법은 매우 빠르고 편리하다. 또한 어는 step에서든 멈출수 있고 ultracentrifugation step과 ethidium bromide를 사용하지도 않는다.

 

A. Materials

 

Glucose/Tris/EDTA solution

10mg/ml DNase-free RNase

NaOH/SDS soln.

Potassium acetate soln.

Buffered phenol

24:1 chloroform/isoamyl alcohol

10M ammonium acetate

100% and 70% ethanol

TE buffer

PEG soln.

3 M sodium acetate, pH 5.5

Sorvall SS-34 or Beckman JA-17 rotor

Sorvall HB-4 rotor

 

 

B. Method

 

1. crude lysate prep.의 마지막 스텝에서 얻어진 pellet을 1ml glucose/Tris/EDTA soln.에 녹인다.

2. 최종농도가 20㎍/ml가 되도록 RNase을 첨가하여 20min, 37℃에서 정치한다.

3. NaOH/SDS soln.을 2ml 첨가한다.

tube를 상하로 뒤집어 섞고 실온에서 5∼10min 정도 정 치한다.

4. 1.5-ml potassium acetate soln.을 첨가하여 tube를 상하로 뒤집어 섞고

실온에서 5∼ 10min 정도 정치한다.

5. 실온에서 10분 동안 원심분리한다(20,000×g).

6. 상등액을 새로운 tube에 옮긴다. 흰색의 침전물은 SDS-potassium complex이다.

이것은 다른 chromosomal DNA를 포함하며 crude lysate가 남아 있다.

7. phenol과 chloroform/isoamyl alcohol로 extract한다.

8. 10M ammonium acetate의 1/4vol을 용액에 넣고 섞는다.

100% ethanol의 2vol을 tube에 넣고 드라이아스에 10min 동안 정치한다.

원심분리(10min, 4℃, 10,000×g)하여 plasmid DNA를 회수한다.

9. 70% ethanol로 pellet을 씻고 vacuum에서 건조시킨다.

2ml TE buffer을 첨가하여 녹이고

0.8ml PEG soln.을 첨가하여 0℃에서 1∼15hr 동안 정치한다.

10. 원심분리(20min, 4℃, 10,000×g)하여 plasmid DNA을 회수한다.

11. 1ml TE buffer에 plasmid DNA를 녹이고 ethanol prep.을 행한다.

12. TE buffer로 침전된 plasmid DNA를 녹인다.

 

<정리>

·plasmid DNA의 charge를 이용 - plasmid와 같은 DNA는 일반적으로 (-)charge를 띠므로 anion-exchange resin을 이용한 column을 사용해 분리.

 

·size를 이용한 분리 - centrifugation을 이용함 (1번)

 

conformation을 이용한 분리 - plasmid는 3가지 형태로 존재

(하나의 plasmid가 electrophoresis상에 3개의 band로 보 인다.)

linear > open circular > supercoiled

 

 

① alkaline denaturation을 이용

- pH변화에 따라서 non-supercoiled DNA가 denaturation되는 성질을 이용

그러나 supercoiled DNA는 안정함

 

ⓐ sodium hydroxide 첨가 (pH 12∼12.5) - non-supercoiled DNA의 H-bond 파괴하여 single stranded DNA형성

ⓑ sodium acetate 첨가 (pH 4.8) - 파괴된 ssDNA가 tangled mass형성

ⓒ centrifugation - tangled mass와 supercoiled DNA의 분리

 

 

② Ethidium bromide

- caesium chloride density gradient centrifugation

- plasmid DNA의 밀도(1.7 g/cm3)를 이용하여 분리

 

ⓐ protein이 가장 위층에, DNA가 중간 그리고 RNA가 가장 아래쪽에 위치

ⓑ EtBr의 도입 - double helix의 부분적인 unwinding을 유발 (>3.4Å),

linear DNA의 사이에 끼어들어 0.125 g/cm3만큼 밀도를 감소시킴

(linear and open circular DNA와 supercoiled DNA의 분리를 초래),

- DNA에 결합된 EtBr은 n-butanol로 제거