7. DNA 전기영동

DNA 전기영동

 

1. 실험 제목: DNA 전기영동 (DNA Electrophoresis)

 

2. 실험 목적 등 배경

 

전기영동(Electrophoresis)이란 특이한 매질 (agarose나 acrylamide)을 이용하여 DNA나 단백질 등의 고분자 물질을 분리하는 방법이다. Agarose에 DNA를 넣고 전기를 걸어주면 DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠므로 매질을 타고 양전하 방향으로 움직이게 된다. 이 때 DNA의 움직이는 속도는 DNA의 크기, 형태 (선형, 원형 등)에 따라 다르므로 매질 내에서 그 특성에 따라 분리되어 진다.

본 실험에서는 제한 효소로 자른 plasmid DNA (특별한 구조를 지니지 않은 선형 DNA)와 제한효소를 처리하지 않은 원형 DNA (superhelical 구조를 지님)를 agarose gel 상에서 직접 전기영동하고 이를 ethidium bromide로 염색 후에 자외선을 이용해 눈으로 직접 확인해 봄으로서 DNA 전기영동의 원리와 과정들에 대해 이해해 보고자 한다.

 

3. 재료 및 실험 기구 및 기기

 

agarose powder 2 g

1X TBE (Tris-borate buffer) 용액 200 ml X 8조

5 X Gel loading dye 용액 100 ul

10 mg/ml ethdium bromide 용액 100 ul

agarose gel caster 8 대

전기영동 장치 (chamber 및 power supply) 4 대

DNA sample (1 kb ladder, pBlueScript plamsid DNA) 각 20 ug

lambda pippetman and yellow tip8 개

삼각 플라스크8 개

전자렌지 또는 전열기1 대

UV transilluminator, 사진기, balance1 대

Mass cycliner1 개

 

* 4명 1조, 8조를 기준으로 작성

 

4. 실험 방법

 

4-1. agarose gel 만들기

1) 2 liter의 1X TAE buffer 용액 (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA)을 먼저 만든다. 5X TAE buffer 용액 400 ml에 증류수를 첨가하여 2 liter를 만든다

* 5X TAE stock 용액 제조: 54 g의 Tris base, 27.5 g의 boric acid,

20 ml의 0.5 M ETDA 용액에 증류수를 첨가하여 최종 1 liter를 만든다.

2) 삼각 플라스크에 1X TAE 용액 25 ml과 0.25 g의 agarose powder를 넣어 전자렌지에서 agarose 입자가 완전히 녹을 때까지 끓여준다.

3) 손으로 댈 수 있을 때 까지 식힌 후에 10 mg/ml의 ethidium bromide 용액을 2 ul 첨가하여 잘 섞은 후에 gel caster에 부어 완전히 굳을 때 까지 기다린다.

 

4-2. DNA 시료의 준비

Gel이 식는 동안 분석하려는 DNA 샘플 5 ul (300 - 500 ng)당 1 ul의 loading dye를 첨가하여 준비한다. 또한 5 ul의 1kb ladder 마커 (1 ug)에 1 ul loading dye를 섞어 분자의 크기를 알 수 있는 표준 샘플도 준비한다.

* loading dye는 50% glycerol에 bromophenol blue를 섞은 것으로 DNA가 gel에 loading될 수 있게 하며 전기영동 동안에 시료의 이동을 확인할 수 있게 한다.

 

4-3. 시료 주입(sample loading)

1) 완전히 굳은 agarose gel에서 조심히 comb을 제거한 후 gel casting tray를 전기영동 탱크에 넣은 후 TBE buffer 용액를 탱크에 부어 gel이 수면으로부터 1-2 mm정도 잠기게 한다.

2) Well의 가장 왼편에 DNA 마커 샘플을 주입하고, 다음 well부터 샘플 (6ul)을 순서대로 주입한다.

3) 샘플을 다 주입하면, gel tank에 전극을 맞추어 연결한다. [gel의 well쪽이 (-)전극 (검정색) 쪽에 위치, DNA는 (+)전극쪽 (빨강색)으로 이동하게 됨]

4) Loading dye의 이동이 gel의 거의 3/4지점까지 내려갈 때까지 전기영동한다.

 

4-5. 사진찍기

1) Gel 탱크의 전원을 끄고 gel을 UV transilluminator로 옮긴 후 보호 장치를 하고 UV light를 켠다.

*주의 : UV transilluminator는 노출 시 피부와 눈에 손상을 입히는 단파장의 UV light를 발산하기 때문에, 반드시 비닐장갑이나 보호장구를 착용해야함.

2) Transilluminator 전원을 켜고 gel을 관찰한다. DNA 밴드(orange band)를 확인 후 사진을 찍고 전원을 끈다.

 

 

실험보고서

 

1. 1kb ladder DNA 마커들이 움직인 거리와 그 크기 사이에는 어떤 상관 관계가 있는지 실측하여 공식으로 나타내 보자.

 

2. Supercoil plasmid DNA 시료에서 보이는 다양한 종류의 DNA들은 각각 어떤 형태이며 이들의 움직임에 차이가 나는 이유는 무엇인가?

 

3. UV를 조사하였을 때 DNA가 오렌지색으로 보이게 되는 이유와 원리는 무엇인가?