8. 형질전환(Transformation)

형질전환(Transformation)

 

1. 실험배경과 목적

 

한 세균으로부터 나온 유래한 DNA를 다른 세균이 받아들임으로써 유전형질이 전환되는 유전자 전달방식인데 Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Bacillus subtilis, Streptococcus sanguis, Neisseria gonorrhoeae, Acinetobacter calcoaceticus에서 잘 연구된 바 있으나, 요즈음은 유전자조작 기술의 발달과 더불어 여러 종류의 세균에서 적용되고 있다. 그런데 어떤 세포에서의 형질전환 과정이 자연적인 과정의 하나로 이루어지기 위해서는 유전자 수용세균이 배지내에 있는 DNA를 세포내로 수용할 수 있는 상태(competent)에 있어야 한다. 또한 접합실험과 마찬가지로 유전자 공여체와 수용세균이 서로 다른 유전형질을 가지고 있어야만 형질전환체(transformant)의 선별이 가능하다.

 

유전자 공여체로 바이러스 DNA를 사용하는 경우를 특별히 transfection이라고 한다. 여기서는 이미 추출한 플라스미드 DNA로 형질전환시키는 방법 중 가장 많이 이용되는 Mandel 과 Higa(1970)의 CaCl2처리법을 살펴보자.

 

2. 실험 재료 및 방법

 

▣ 재 료

․Escherichia coli HB101, 플라스미드 pBR322 DNA, LB broth 배지

․Ampicillin(Am)이 포함된 LB-한천평판배지, 10mM Tris-HCl(pH8.0)에 녹인 50mM CaCl2 용액 TE 완충용액(pH8.0)

 

▣ 과 정

① 500 ml짜리 플라스크에 들어 있는 100 ml의 L-액체배지에 하룻밤 배양한 E.coli HB101 배양액 1ml을 가하고 격렬하게 진탕하면서 37℃에서 2~4시간 배양하여 균의 밀도가 약 5× 107 세균/ml (O.D. 600≒0.5에 해당됨) 되게 한다.

② 배양체를 얼음에 약 10분 담그어 식힌 후 20ml을 취하여 4℃, 4000g에서 5분간 원심분리한다.

③ 상등액을 버린 다음, ice-cold한 멸균된 50 mM CaCl2 용액을 원래의 ½부피(15ml)만큼 가하여 현탁시킨다.

④ 얼음에 15분 방치한 후, 다시 원심분리한다.

⑤ 이를 다시 원래의 1/15부피만큼(2ml)의 50mM CaCl2 용액에 다시 현탁시킨 후, 미리 차게 식혀 둔 미세원심분리관에 0.2ml씩 나누어 담고 4℃에서 12 - 24시간 보관한다.

⑥ TE 완충용액에 0.5㎍/ml 되게 녹인 pBR322 DNA용액 (또는 ligation된 재조합 DNA)을 CaCl2 처리한 E. coli가 들어 있는 미세원심분리관에 2㎕씩 가한다.

⑦ 42℃항온수조에서 1분 방치한다.

⑧ L-액체배지 1㎖을 가하고 37℃에서 1시간 배양한다.

⑨ 적당량(0.1 - 0.2 ml)의 배양액을 항생제가 첨가된 LB 한천평판에 삼각유리봉으로 도말 한다.

⑩ 평판을 뒤집어 37℃에서 배양한다. 대개 12 - 16시간이면 콜로니가 형성된다.

3. 실험수행상 주의 할 점

 

․형질전환률을 최대로 하기 위해서는 대수기(exponential phase)의 세균을 사용하고,

CaCl2 처리시에는 세균 밀도가 낮은 것이 좋다.

또한 ⑤과정에서와 같이 4℃에서 12 - 24시간보존한 후 DNA와 반응시키면 형질전환 률이 4 - 6배 증가하나, 24시간을 경과하면 감소함에 유의할 것.

 

․Amp 내성 형질전환체를 선별하고자 할 때는 평판배지 당 세균의 밀도가 낮게 접종하고 배양 16 - 24시간 후에는 4℃에 보관하도록 한다. 왜냐하면 내성균이 분비하는 배지내의 β-lactramaserk 확산되어 콜로니주변 배지의 Amp이 분해되어 접종 밀도가 높거나, 배양 시간이 길면 Amp 감수성 균도 자랄 수 있게 되게 때문이다.

 

 

실험보고서

 

[결과]

형질전환률을 다음에 의거하여 구하라.

 

형질전환률 = 형질전환체의 수/플라스미드 DNA랑(㎍)

 

 

 

[물음]

1. 형질전환시 플라스미드 DNA의 농도가 높고, 가하는 DNA용액의 부피가 크면 형질전환률이 떨어지는 이유를 생각해 보라.

 

2. CaCl2 처리의 목적을 살펴보고, 이와 동일한 효과를 내는 처리법들이 (즉 DNA가 세균 세포내로 도입되도록 도와주는 방법)어떠한 것이 있는가 살펴보자.