Seize the day!

Plasmid DNA의 분리 및 정제방법

 

플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chromosomal DNA 로부터 분리하여야 한다. 플라스미드 분리방법은 플라스미드 DNA와 bacterial DNA의 물리적인 차이점에 의해 분리된다. 가장 큰 플라스미드의 길이는 E. coli 의 염색체 길이에 8%밖에 되지 않으며 대부분이 작다.

플라스미드와 bacteria DNA의 구조에 차이로부터 분리하는 방법이 있다. 플라스미드와 염색체는 구형인데 염색체는 extract 시 구형에서 선형조각으로 깨어지며 플라스미드에는 구형으로써 변화가 없다. 이 구조적인 차이점을 이용하여 정제된 플라스미드를 얻을 수 있다.

 

<분리방법> :Minipreps of plasmid DNA

bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법은 대단히 많지만

성공률과 속도를 생각하여 세 가지 방법으로 소개하면

Alkaline lysis prep, boiling method 그리고 lithium-based procedure 이다.

 

① Alkaline lysis miniprep

 

alkaline lysis procedure(Bimboim, Doly, 1979)은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다(여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다). 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며(SDS는 potassium과 화합물을 이룬다) 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.

 

A. Materials

1.Soln.1 (lysis soln)-autoclave

100ml preparation

50mM Glucose 0.9g

10mM EDTA(pH 8.0) 2ml 0.5M EDTA

25mM Tris.cl(pH 8.0) 25ml 0.1M Tris.cl

D.W Up to 100ml

 

2.Soln.2 (NaOH/SDS soln)-autoclave, Fersh soln only

20ml preparation

0.2N NaOH 0.16g NaOH

1w/v% SDS 0.2 g SDS

D.W Up to 20ml

Store at r.t,if white granules detected MUST discard!

cf) Quick preparation

Autoclaved 2g/50ml (1N) NaOH 4ml -+

Autoclaved 10w/v% SDS 2ml -+ 40℃에서 녹여서 사용

Autoclaved D.W 16ml -+

3.soln.3 -M(KOAc 3M,pH 4.8)-autoclave

100ml preparation

5M KOAc (94.15g/200ml D.W) 60ml

Glacial HOAc 11.5ml

D.W 28.5ml

 

4. RNase solution

20mg pancreatic RNase/ml in 10mM Tris HCl(pH 7.5), 15mM NaCl

Heat at 100'C for 15min, and store at -20℃

 

5. TE buffer

10mM Tris HCl(pH 8.0)

1mM EDTA(pH 8.0)

 

B. Procedure

 

1 .Grow cell culture in L broth + Ampicillin(100ug/ml final conc.)overnight.

2. Take 1.0ml cell suspention into 1.5msl Eppendorf tube.Centrifuge 15 seconds in 10,000×g

3. Remove supernatant carefully with fine aspirator

4. Lysis soln. preparation ; 4mg lysozyme/ml soln.1

5. Add 100ul Lysis soln. to suspend the pellet and hold at r.t 5min.

cf) 만일 cell culture 가 없고 plate에 긁어 놓은 것이 있으면 이쑤시게를 이용 좁쌀크기로 떠내서 바로 soln.1을 넣은 tube에 넣고 가볍게 vortexing을 실시하여 suspention시킨 것을 이용한다.

6. Add 200ul NaOH/SDS reagent(soln.2) mix and hold on ice bed 5min.

soln.2가 들어가면 투명하게 되며 점도가 높은 것이 ice-bed에 두면 점성이 낮아진다.

7. Add 150ul of KOAc(pH4.8,Soln.3-M),flicking,and store the tube on ice bed 5min.

soln.3가 들어가면 하얗게 되며 ice bed에 두면 점도가 낮아지고

liquid phase와 protein/gDNA phase가 구분되어진다.

8. Add 400ul of PCI(25:24:1),mix and centrifuge 5min.at 15℃

9. Transfer the supernatent to a fresh tube,

Add 500ul 100% EtOH,vortex 10sec, and stay for 5min. at r.t.

10. Centrifuge 5min.at 15oC and discard the supernatent

11. Drain off the EtOH completely and vacuum pump drying 15min.

12. Resuspention the pellet with 20ug/ml RNase contained 43ul D.W or TE buffer.

 

 

② Boiling miniprep

 

Plasmid를 지닌 bacteria는 lysozyme, Triton(a nonionic detergent), 열처리 등으로 깨어질수 있다. chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을 수 있으며 plasmid DNA는 상등액에서 isopropanol(Holmes and Quigley,1981)로 침전시켜 분리할 수 있다. boiling miniprep는 적은 양의 plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만 분리된 plasmid DNA는 alkaline lysis miniprep 보다 quality가 떨어진다.

 

A. Material

LB medium(적합한 항생제가 첨가된 배지)

STET soln.

Hen egg white lysozyme

Isopropanol, ice-cold

TE buffer

10 mg/ml DNase-free RNase

1.5-ml microcentrifuge tubes

Boiling water bath(100℃)

B. Procedure

 

1. 단일콜로니를 5ml 멸균된 LB medium에서 overnight 한다

(37℃에서 최소한 mid-log phase 까지 배양한다).

2. 1.5ml의 종배양액을 1.5ml microcentrifuge tube에 옮기고 원심분리하여 cells을 모은다 (pellet). 상등액을 제거한다.

3. 200㎍ lysozyme이 든 STET soln. 300㎕에 pellet을 녹인다.

4. 30s∼10min정도 얼음물에다 tube를 정치한다.

5. boiling water bath(100℃)에 1∼2 min 정도 tube를 정치한다.

6. 15∼30min정도 원심분리한다.

7. pipet으로 상등액을 새로운 tube에 옮긴다(이때 pellet에 주의하여 옮긴다).

200㎕(상등 액과 같은 양) cold isopropanol에 섞는다.

-20℃에서 15∼30 min 정도 정치한다. 다시 5 min 정도 원심분리한다.

8. 상등액을 제거하고 pellet이 마를 때 까지 진공상태로 정치한다.

9. 50㎕ TE buffer에 pellet을 녹여 보관한다.

 

 

 

③ Lithium miniprep

 

Plasmid DNA는 평판 또는 액체배지에서 배양되는 E.coli로부터 획득할 수 있는데, Bacterial cells은 Triton X-100/LiCl과 phenol/chloroform을 처리하여야만 한다. 이것은 plasmid DNA의 가용성화와 chromosomal DNA, cellular debris등에 침전을 일으킨다. debris는 원심분리를 통해 제거할 수 있다. 이러한 분리절차로 chromosomal DNA 등을 제외한 plasmid DNA만을 얻을 수 있다.

이번 분리방법은 가장 빠르게 plasmid DNA를 분리하는 방법이며 대부분의 생물학적 적용면에 이용할 수 있는 정제된 plasmid DNA를 분리할 수 있다.

 

A. Materials

 

TELT soln.

LB medium(항생제첨가배지)

1:1(w/v) phenol/chloroform

100% ethanol(-20℃보관)

TE buffer

10mg/ml DNase-free RNase A

1.5ml microcentrifuge tubes

 

 

B. Procedure

 

1. 형질전환체 colonies로부터 plasmid DNA를 분리하기 위해 다음과 같이 세포를 준비.

a. microspatula를 이용하여 LB agar plate에 있는 bacterial colony(2∼5mm diameter까지 배양된 colony)을 떼어 100㎕ TELT soln.이 들어있는 1.5-ml microcentrifuge tube에 옮긴다.

 

b. step 3의 과정을 위해 위의 혼합액을 Vortex하여둔다.

2. 액체배지로부터 plasmid DNA를 분리하기위하여 다음과 같이 세포를 준비하여둔다.

a. 적합한 항생제가 첨가된 1.8ml LB medium에 bacteria colony를 배양한다

(대략 30℃, 18∼24hr까지 진탕배양).

b. 신중히 배양액을 1.5-ml microcentrifuge tube에 옮긴다.

c. 세포를 원심분리(10,000×g, for 20sec)하여 pellet을 형성시킨다.

d. tube를 수직상태로 들고 상등액을 aspirator로 제거한다.

e. 100㎕ TELT soln.을 pellet에 넣고 vortex로 녹인다.

 

3. 100㎕ 1:1 phenol/chloroform을 첨가하고 5sec 정도 vortex를 한다.

4. 원심분리(15,000×g, for 1min)를 한다.

5. pipettor를 이용하여 신중히 75㎕ upper aqueous phase를 빼내어 새로운 microcentrifuge tube에 옮긴다.

6. 상등액에 150㎕ 100% ethanol(chilled)를 첨가, plasmid DNA가 침전될 수 있도록 섞는다.

7. 원심분리(for 5min)하여 pellet을 형성시킨다.

8. 상등액을 제거한다.

9. 1ml cold 100% ethanol로 씻어주고 step 6과 7을 반복하여 nucleic acid pellet을 회수 한다.

10. tube를 cap으로 닫고 cap에 작은 구멍을 낸다. vacuum dessicator에 tube 위치시켜 놓 는다. nucleic acid pellet이 완벽하게 마를때까지 진공상태를 유지한다.

11. 30㎕ TE buffer에 녹인다.

 

 

 

 

 

 

<정제방법>

 

1. CsCl/Ethidium Bromide Equilibrium Centrifugation에 의한 plasmid DNA 정제

 

이 방법은 대부분의 contaminants로부터 정제도가 높은 plasmid DNA 얻을 수 있다. 그러나 ethidium bromide의 사용과 밀도구배를 위해, 많은 시간이 걸리는 초원심분리가 필요하다.

 

 

A. Material

 

TE buffer

Cesium chloride

10mg/ml ethidium bromide

CsCl/TE Soln.

Dowex AG50W-X8 cation exchange resin

TE buffer/0.2M NaCl

100% and 70% ethanol

Beckman VTi65 or VTi80 rotor(or equivalent)

5ml quick-seal ultracentrifuge tube

3ml syringes with 20-G needles

B. Procedure

 

1. 4ml TE buffer 로 crude lysate prep.의 마지막 스텝에서 얻어진 pellet을 녹인다.

또한 4.4g CsCl 첨가하여 용해시키고 10mg/ml ethidium bromide의 0.4ml를 가한다.

<주의할점>

Ethidium bromide는 돌연변이원이며 환경에 매우 위험한 물질이므로 이용시 신중하게 해야하며 장갑을 끼고 실험을 하도록 한다.

ethidium bromide는 용액에 남아있는 단백질과 화합물을 이루어 진한 적생을 형성하여 침전된다. 이 침전물은 lysate-CsCl/ethidium bromide 용액을 실온, ∼2000×g로 원심분리 하여 제거할 수 있다.

이 절차 후에는 protein/ethidium bromide complex는 용액의 상위 부위에 하나의 disc를 형성한다. 용액을 pipett을 이용하여 disc 아래부위만을 뽑아낸다.

 

2. 5-ml ultracentrifuge tube에 용액을 옮긴다. 필요시 CsCl/TE 용액으로 채우고 밀봉한 다. 원심분리(3.5hr at 20℃, 500,000×g 또는 14hr at 350,000×g)에서 원심분리하여 plasmid band를 형성시킨다.

*이 step은 매우 중요한 부분으로 원심분리 시 온도가 15℃ 이하에서 시행하여야 한 다. 구배를 하기 위해서 고농도의 cesium chloride와 높은 원심력이 필요하기 때문이며 낮은 온도에서 시행m시 cesium chloride가 tube 바닥으로 침전이 된다.

 

3. 20-G needle을 tube의 상위부분에 조심스럽게 삽입하고 3-ml syringe과 다른 20-G needle결합시켜 plasmid band의 ∼ 1cm 아랫부위에 주입시켜 plasmid band를 흡입한다.

 

4. 만약 고도로 정제된 plasmid DNA를 얻기 위해서라면 두 번째 ultracentrifuge를 시행하 여 RNA와 chromosomal DNA를 제거한다.

 

5. 유리 또는 플라스틱 column에 plasmid DNA/ethidium bromide용액 부피의 1.5∼2배 정도 의 Dowex AG50W-X8 column을 채운다.

그것을 wash과 평형을 위해 TE buffer/0.2 M NaCl 를 column에 흘려보낸다.

 

6. resin을 건들지 않고 그 위에 직접적으로 plasmid DNA/ethidium bromide용액을 채운다.

 

7. loading 후 직접적으로 column으로부터 흘러 나오는 용액을 수집하기 시작한다. volume laded의 두배가 되는 TE buffer/0.2M NaCl을 column에 흘려보낸다.

plasmid DNA는 resin을 통해 흘러 나오고 ethidium bromide는 resin에 남아 있게 된다 (윗부분은 적색을 띤다).

 

8. 2vol의 100% ethanol(-20℃보관)를 plasmid DNA에 가하여 원심분리(10min 4℃, 10,000×g).

<주의 할점>

이 용액은 -20℃이하가 되면 안되는데 : cesium chloride가 침전되기 때문이다.

 

9. 70% ethanol로 wash 후 vacuum상태에서 건조시킨다. TE buffer로 pellet을 녹이고 4℃에 서 보관한다.

2. PEG Precipitation

 

이 방법은 매우 빠르고 편리하다. 또한 어는 step에서든 멈출수 있고 ultracentrifugation step과 ethidium bromide를 사용하지도 않는다.

 

A. Materials

 

Glucose/Tris/EDTA solution

10mg/ml DNase-free RNase

NaOH/SDS soln.

Potassium acetate soln.

Buffered phenol

24:1 chloroform/isoamyl alcohol

10M ammonium acetate

100% and 70% ethanol

TE buffer

PEG soln.

3 M sodium acetate, pH 5.5

Sorvall SS-34 or Beckman JA-17 rotor

Sorvall HB-4 rotor

 

 

B. Method

 

1. crude lysate prep.의 마지막 스텝에서 얻어진 pellet을 1ml glucose/Tris/EDTA soln.에 녹인다.

2. 최종농도가 20㎍/ml가 되도록 RNase을 첨가하여 20min, 37℃에서 정치한다.

3. NaOH/SDS soln.을 2ml 첨가한다.

tube를 상하로 뒤집어 섞고 실온에서 5∼10min 정도 정 치한다.

4. 1.5-ml potassium acetate soln.을 첨가하여 tube를 상하로 뒤집어 섞고

실온에서 5∼ 10min 정도 정치한다.

5. 실온에서 10분 동안 원심분리한다(20,000×g).

6. 상등액을 새로운 tube에 옮긴다. 흰색의 침전물은 SDS-potassium complex이다.

이것은 다른 chromosomal DNA를 포함하며 crude lysate가 남아 있다.

7. phenol과 chloroform/isoamyl alcohol로 extract한다.

8. 10M ammonium acetate의 1/4vol을 용액에 넣고 섞는다.

100% ethanol의 2vol을 tube에 넣고 드라이아스에 10min 동안 정치한다.

원심분리(10min, 4℃, 10,000×g)하여 plasmid DNA를 회수한다.

9. 70% ethanol로 pellet을 씻고 vacuum에서 건조시킨다.

2ml TE buffer을 첨가하여 녹이고

0.8ml PEG soln.을 첨가하여 0℃에서 1∼15hr 동안 정치한다.

10. 원심분리(20min, 4℃, 10,000×g)하여 plasmid DNA을 회수한다.

11. 1ml TE buffer에 plasmid DNA를 녹이고 ethanol prep.을 행한다.

12. TE buffer로 침전된 plasmid DNA를 녹인다.

 

<정리>

·plasmid DNA의 charge를 이용 - plasmid와 같은 DNA는 일반적으로 (-)charge를 띠므로 anion-exchange resin을 이용한 column을 사용해 분리.

 

·size를 이용한 분리 - centrifugation을 이용함 (1번)

 

conformation을 이용한 분리 - plasmid는 3가지 형태로 존재

(하나의 plasmid가 electrophoresis상에 3개의 band로 보 인다.)

linear > open circular > supercoiled

 

 

① alkaline denaturation을 이용

- pH변화에 따라서 non-supercoiled DNA가 denaturation되는 성질을 이용

그러나 supercoiled DNA는 안정함

 

ⓐ sodium hydroxide 첨가 (pH 12∼12.5) - non-supercoiled DNA의 H-bond 파괴하여 single stranded DNA형성

ⓑ sodium acetate 첨가 (pH 4.8) - 파괴된 ssDNA가 tangled mass형성

ⓒ centrifugation - tangled mass와 supercoiled DNA의 분리

 

 

② Ethidium bromide

- caesium chloride density gradient centrifugation

- plasmid DNA의 밀도(1.7 g/cm3)를 이용하여 분리

 

ⓐ protein이 가장 위층에, DNA가 중간 그리고 RNA가 가장 아래쪽에 위치

ⓑ EtBr의 도입 - double helix의 부분적인 unwinding을 유발 (>3.4Å),

linear DNA의 사이에 끼어들어 0.125 g/cm3만큼 밀도를 감소시킴

(linear and open circular DNA와 supercoiled DNA의 분리를 초래),

- DNA에 결합된 EtBr은 n-butanol로 제거

 

 

 

 

 

 

 

Plasmid Preparation

 

Introduction

Alkali lysis method 의 원리 / Solution I, Solution II, Solution III

Supercoiled(closed circular) DNA와 open circular DNA

DNA precipitation(ethanol) / Biophotometer

 

I. Goal

DNA preparation 과정을 구분하여 이해하고 원리를 설명할 수 있다.

 

II. Materials

Cell,

Solution I,

Solution II,

Solution III,

phenol:chloroform(1:1),

100% ethanol,

SDW, ice,

LA(LB+Ampicillin) plate,

 

III. Procedure

1. 항생제가 첨가된 plate에 자란 colony를 백금선 루프로 한 개 따서 동일한 항생제가

2. 3 μl가 첨가된 LA배지에 seeding하여 37°C incubator에서 12-16시간 배양한다.

3. 10시간 이상 배양한 cell 1.5ml를 eppendrof tube로 옮겨 14,000rpm에서30sec - 1min하거나 15ml culture tube 일경우3,000rpm에서 15-20min

4. 상층액을 버리고, cell pellet에 Solution I를 100 μl 넣고 vortexing 하여 완전히 녹인다.

5. Solution II를 200 μl첨가한 후, tube를 inverting 하여 조심스럽게(5-6회) 섞어준다.

6. Solution III를 150μl 첨가하여 inverting하여 섞어준다.

7. ice에 5min간 놓아둔다.

8. 4°C, 15,000rpm으로 5min centrifuge한 후 상층액을 new eppendrof tube에 옮기고 남아있는 protein을 제거하기 위해 phenol:chloroform(1:1)을 상층액과 동일한 부피로 섞어서 10-15sec vortexing 후 Max.rpm에centrufuge한다.

9. centrifuge한 tube의 상층액을 new tube에 옮긴 후 2-2.5volume의 100% ethanol를 첨가한 후 흔들어준다.

10. 4°C, Max.rpm에centrifuge 10-15min 하면 yellowish white pellet이 생성된다.

11. ethanol을 pellet에 영향을 주지 않고 제거한 후에 spin-down 시키고 상온에서 건조시킨다.

12. 생성된 pellet의 양에 따라 적량의 SDW로 녹인다.

13. miniprep 한DNA 1μl + SDW 49μl로 dilution 시킨 후에 DNA concentration를 Biophotometer로 측정한다.

IV. Results

chromosomal DNA와 plasmid DNA의 분리 과정을 설명할 수 있다.

E.coli 배양 및 관련 시약 준비

 

1.1. A. Plate의 제조

 

Plate는 박테리아가 자랄 수 있는 최적의 환경이어야 한다. 박테리아는 plate 상에서 자라 colony를 형성하는데, 한 개의 colony는 한 개의 clone으로부터 자란 것이므로 이를 분획하여 여러 실험에 사용할 수 있게 된다. Plate의 조성은 배양시 사용하는 액체 배지(media)의 조성에 agar를 첨가한 것이다. 이때 첨가하는 agar의 농도는 1.5%이며, top agar와 같은 특수한 용도로 사용하기 위해서는 agar의 농도를 변화시키기도 한다.

 

실험방법

 

1. Plate를 만들고자 하는 배지를 만든다. 각 배지의 조성은 다음과 같다.

 

1) LB 배지 (Luria-Bertani medium) 1 liter

 

1.1.1.1. bacto-tryptone 10 g

1.1.1.2. bacto-yeast extract 5 g

1.1.1.3. NaCl 10 g

1.1.1.4. * 실험실에서 가장 흔히 사용되는 배지이다. 위 성분 950 ml의 증류수에 녹인 후 pH를 7로 맞추기 위해 5 N NaOH를 첨가(약 200 μl)하고 증류수로 1 liter로 채운다음 autoclave한다.

 

2) TB 배지 (Terrific Broth) 1 liter

 

1.1.1.5. bacto-tryptone 12 g

1.1.1.6. bacto-yeast extract 24 g

1.1.1.7. glycerol 4 ml

1.1.1.8. * Glycerol이 첨가되어 균을 단시간에 대단히 높은 농도로 배양할 수 있는 배지이다. 900 ml의 증류수에 녹인 후 autoclave한다. 사용하기 직전에 phosphate buffer(0.17 M KH2PO4, 0.72 M K2HPO4)를 100 ml 첨가한 후 사용한다. Phosphate buffer는 90 ml 증류수에 2.31 g의 KH2PO4와 12.54 g의 K2HPO4을 잘 녹인 후 증류수로 100 ml 까지 채우고 멸균하여 사용한다.

 

3) SOB 배지1 liter

 

1.1.1.9. bacto-tryptone 20 g

1.1.1.10. bacto-yeast extract 5 g

1.1.1.11. NaCl 0.5 g

1.1.1.12. * Competent cell 제조시에 사용하는 배지이다. 950 ml의 증류수에 녹인 후 250 mM KCl 10 ml를 첨가하고 5 N NaOH를 이용하여 pH를 7로 맞춘 다음 증류수로 1 liter까지 채우고 autoclave한다. 사용하기 직전에 멸균한 2 M MgCl2를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하여 사용한다.

4) SOC 배지 (Terrific Broth)

 

* 20 mM의 MgCl2가 함유된 SOB 배지에 20 mM glucose가 첨가된 배지이다. 1 M glucose 용액은 100 ml에 18 g의 glucose를 녹여 0.22 μm-pore의 filter를 통과시켜 사용한다. 박테리아의 형질전환시에 사용한다.

 

5) M9 Minimal 배지 1 liter

 

1.1.1.13. Na2HPO4-7H2O 6 g

1.1.1.14. KH2PO4 3 g

1.1.1.15. NaCl 0.5 g

1.1.1.16. NH4Cl 1 g

1.1.1.17. * M13 phage의 cloning 시에 사용할 수 있다. M9 plate를 제조하는경우는 agar 첨가 후 멸균한 배지가 적당히 식었을 때 다음과 같은 것들을 넣어준 다음 plate를 만들어야 한다.

1.1.1.18. 20% glucose (filtered) 10 ml

1.1.1.19. 0.1 M CaCl2 (autoclaved) 1 ml

1.1.1.20. 1 M MgSO4 (autoclaved) 1 ml

1.1.1.21. 100 mg/ml Thiamine (filtered) 50 ml

 

6) Brain infusion 배지 (Penassay 배지) 1 liter

 

1.1.1.22. 0.15% beef extract

1.1.1.23. 0.15% yeast extract

1.1.1.24. 0.5% peptone

1.1.1.25. 0.1% glucose

1.1.1.26. 0.35% NaCl

1.1.1.27. 0.37% K2HPO4

1.1.1.28. 0.13% KH2PO4

 

* 시약상에서 혼합된 가루를 판매하므로 1 liter를 제조하기 위해 37 g을 혼합하여 사용한다.

2. 위의 배지는 액체로 사용하기도 하는데, 이를 이용한 plate를 만드는 경우 autoclave를 하기 전에최종농도 1.5%가 되도록 agar powder(15 g/liter)를 첨가한다.

3. 15 lb/sq로 20분 이상 autoclave한다.

 

4. 배지가 적당히(65°C 정도) 식을 때까지 기다린 후 필요하면 ampicillin을 60 μg/ml가 되도록 첨가하고 잘 흔들어 섞는다.

* Ampicillin은 가루를 증류수에 녹여 50~100 mg/ml의 농도로 만들고 filter 후 1 ml 씩 분주하여 -20°C에 보관한다.

 

5. 배지를 petridish에 조심스럽게 붓고 기포가 생기면 달구어진 loop를 이용하여 제거한다. 하루정도 상온에 놓아둔 후 wrap으로 잘 싸서 4°C에 뒤집어서 보관한다.

* 배지의 온도가 너무 높으면 ampicillin의 활성이 떨어지고, 배지가 너무 식으면 plate를 제조하는 도중 배지가 굳을 가능성이 있으므로 적당한 온도에서 작업할 수 있도록 한다.

B. Competent cell의 제조

 

박테리아를 형질전환(transformation)시키는 대부분의 방법은 수많은 과학자들이 경험적으로 정리한 것이며 그 기전은 정확히 알려지지 않았다. 현재 실험실에서 competent cell을 제조하는 방법으로 다음과 같은 두가지가 주로 사용된다. 첫번째 방법은 fresh frozen 방법으로 DH1, DH5, MM294등의 E. coli를 높은 효율(5 ×108 transformed colonies/μg of supercoiled DNA)로 형질전환시킬 수 있으며, strain에 따라서 효율이 떨어지기도 하지만 사실상 거의 모든 경우에 사용할 수 있는 방법이다. 보다 간단한 방법인 두번째 방법은 calcium chloride를 이용하며 대략 107 transformed colonies/μg of supercoiled DNA의 효율을 가지고 있다.

 

1) Fresh 또는 frozen 방법을 이용한 competent cell의 제조

 

이 방법은 Hanahan(1983)에 의해 개발된 방법으로 DH1, DH5, MM294등의 strain을 높은 효율로 형질전환할 수 있다. 다른 strain에서는 약 5～10배 정도 효율이 떨어지고, MC1061 등은 이 방법으로 형질전환이 되지 않는다. 분주하여 -70°C deep freezer에서 2~3개월간 보관하여도 효율이 별로 감소하지 않는다.

 

실험방법

 

1. Agar plate(LB 또는 SOB)에 자란 E.coli DH5α colony를 SOB medium 3 ml(20 mM이 되도록 2 M MgCl2를 30 μl 첨가)에 접종한 후 밤새 키운다. 효율을 증가시키기 위해서는 -70°C deep freezer에 보관한 frozen bacterial stock에서 새로 streak한 plate를 사용하는 것이 좋다.

2. 위에서 자란 균 2 ml를 200 ml의 SOB medium(20 mM이 되도록 2 M MgCl2 를 2 ml 첨가)에 다시 접종한 후 O.D.600이 0.4가 될 때까지 shaking incubator에서 키운다. 보통 약 3～4시간이 소요되며, 약 2시간 이후부터 30분마다 O.D.를 계속 측정해보는 것이 좋다(효율을 증가시키기 위해서 배양된 세균 수가 108 cells/ml를 넘지 않는 것이 좋다). 이론상 E.coli는 최적 조건에서 doubling time이 20분이므로 이에 맞추어 시간을 추정해 볼 수 있으나 배양조건을 고려해야 한다.

3. 배양액을 멸균된 50 ml conical tube 4개에 나누어 넣고 얼음에 10분 방치한다.

4. 4,500 rpm, 4°C에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집은 상태로 약 1분간 놓아둔다.

5. 배양 부피의 1/3(tube당 15 ml) 되는 frozen storage buffer(FSB)에 세포침전물을 부유시킨 다음, 두 tube씩 합쳐서 30 ml 씩으로 만든 후 얼음에 10분 놓아둔다. FSB의 성분은 표 1과 같다.

* 침전된 균을 부유시킬 때 vortex 보다는 pipetting으로 부유시키는 것이 좋은데, 이때 15 ml을 모두 넣고 부유시키려면 잘 되지 않는다. 처음 1~2 ml을 넣고 잘 부유시킨 다음에 15 ml 까지 FSB로 채우고, 잠깐동안 약하게 vortex를 하는 것이 좋은 방법이다.

6. 위와 같이 다시 원심분리한 후 처음 배양 부피의 1/12.5(tube 당 8 ml)되는 FSB에 부유시키고, 두 tube를 합쳐서 16 ml로 만든다.

7. DMSO를 3.5%(V/V)만큼 가한다(560 μl). 이때 DMSO는 세포 부유액의 중앙에 떨어뜨리고 곧바로 tube를 기울이면서 5～10초간 부드럽게 섞도록 한다.

8. 얼음에 5～15분 놓아둔다.

9. 다시 같은 양의 DMSO를 가하여 최종 농도가 7%(V/V)이 되도록 하고, 얼음에 10~15분 둔다.

10. 미리 차게해 둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주한다.

11. 사용할 때까지 -70°C deep freezer에 보관한다. 상온에 나와 한번 녹았던 competent cell은 다시 보관할 경우 효율이 대단히 감소하므로 버려야 한다.

표 1. FSB 제조 (1 liter)

Reagent	Amount required/liter	Final concentration
1M Potassium acetate(pH7.5)	10 ml	10 mM
MnCl2-4H2O	8.91 g	45 mM
CaCl2-2H2O	1.47 g	10 mM
KCl	7.46 g	100 mM
Hexamminecobalt chloride	0.80 g	3 mM
Glycerol	100 ml	10 %

 

1 M potassium acetate는 90 ml의 순수한 물에 9.82 g의 potassium acetate를 녹인 후, 2 M acetic acid로 pH를 7.5로 맞춘 다음 물을 가하여 최종 부피가 100 ml 되도록 만든다. 만든 용액은 10 ml씩 나누어 -20°C에 보관한다.

 

* 위의 성분들을 모두 섞어 800 ml의 증류수에 녹인 다음, 0.1 N HCl을 이용하여 pH를 6.4로 맞춘다. 만약 pH가 6.4보다 낮아졌다면 염기를 가하여 다시 맞추지 말고 용액을 버린 다음 다시 처음부터 시작하여야 한다. 마지막으로 증류수로 최종 부피를 1 liter로 만든 다음 0.45-micron pore size filter로 여과하여 멸균된 용기에 담아 4°C에 보관한다.

 

 

2) Calcium chloride를 이용한 competent cell의 제조

 

이 방법은 Cohen등에 의해 개발된 방법을 약간 변형시킨 것으로, 효율은 Hanahan 방법에 비해 떨어지나 간편하고 보통 cloning목적으로 사용하기에는 충분하므로 실험실에서 많이 사용되는 방법이다. 이 방법으로 만든 competent cell은 시간이 오래 지날수록 형질전환 효율이 다소 감소하긴 하지만 -70°C deep freezer에 보관하여 사용할 수 있다.

 

실험방법

 

1. LB plate에 자란 DH5α colony를 LB 배지 2 ml에 접종한 후 밤새 키운다.

2. 위에서 키운 배양액 1 ml을 100 ml LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.600 이 0.4가 될 때까지 37°C shaking incubator에서 키운다.

3. 배양액을 50 ml conical tube에 넣고 얼음에 10분간 놓아둔다.

4. 4°C에서 4,500 rpm으로 10분간 원심분리한다.

5. 상층액을 완전히 제거한 후 미리 차게 해 둔 0.1 M filtered CaCl2 용액을 원래의 1/2부피로 넣고 부유시킨다.

6. 얼음에 15분 놓아두었다가 다시 4°C에서 3,000～4,000 rpm으로 10분간 원심분리한다.

7. 상층액을 버리고 처음의 1/10 부피의 filtered CaCl2 용액으로 부유시킨다.

8. 얼음에 30분 놓아두었다가 미리 차게 해둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주하고, 사용할 때까지 deep freezer에 보관한다.

 

3) Ultra-competent cell의 제조(Inoue method)

 

최근에 Inoue에 의해 소개된 방법이다(Gene 96: 23-28, 1990). 낮은 온도에서 배양한 균을 쓰는 것이 특징으로, 대단히 높은 효율의 competent cell을 얻을 수 있다.

 

실험방법

 

1. Agar plate(LB 또는 SOB)에 자란 E.coli DH5α colony를 LB 또는 SOB medium(10 mM MgCl2와 10 mM MgSO4 함유) 3 ml에 접종한 후 밤새 키운다.

2. 위에서 자란 균 1~2 ml을 250 ml의 SOB medium에 다시 접종한 후 18°C~상온에서 O.D.600이 0.6이 될 때까지 shaking incubator에서 키운다.

 

* 18°C에서 배양하는 것이 힘들 때가 많기 때문에 상온에서 배양을 하게 되지만, 낮은 온도에서 배양하는 것이 높은 효율의 세포를 얻게 되는 주요 과정이다. 균 농도 보다는 배양 온도에 신경을 쓸 것. 전날 colony 한 개를 접종한 후 overnight으로 배양하면 아침에 대략 이 정도의 균 농도가 된다.

 

3. 배양액을 멸균된 50 ml conical tube에 나누어 넣고 얼음에 10분 방치한다.

4. 4,500 rpm, 4°C에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집은 상태로 약 1분간 놓아둔다.

5. 미리 차게 해 둔 80 ml의 transformation buffer(TB)로 부드럽게 부유시킨 후 얼음에 10분 놓아둔다. TB의 성분은 10 mM PIPES, 55 mM MnCl2, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl이며, pH 6.7로 맞춘 용액이다.

6. 위와 같이 다시 원심분리한 후 20 ml의 TB에 부유시키고 DMSO를 7%(V/V)만큼 가한다. 이때 DMSO는 세포 부유액을 섞으면서 중앙에 천천히 떨어뜨린다. 다 넣은 후에도 5～10초간 부드럽게 섞도록 한다.

7. 얼음에 10분 놓아둔다.

8. 미리 차게해 둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주한다.

9. 사용할 때까지 -70°C deep freezer에 보관한다.

 

 

 

 

 

C. 박테리아의 형질전환

 

박테리아의 형질전환이란 plasmid DNA를 세포 내로 넣어주는 작업을 말한다. 형질전환은 거의 모든 cloning과정에 필수적이므로 가능한 한 효율적인 방법을 찾는 것이 중요하다. Large DNA는 small DNA보다 형질전환 효율이 떨어지며 DNA의 양이 너무 많아도 좋지 않으므로, 같은 competent cell을 사용하더라도 적당한 길이와 적당한 양의 DNA를 사용하는 것이 중요한 요소이다.

실험방법

 

1. -70°C deep freezer에 200 μl 씩 보관된 competent cell tube 하나를 꺼내어 손바닥에 쥐고 있으면 cell 용액이 녹기 시작한다. Cell 용액이 다 녹으면 곧바로 얼음에 넣어둔다.

2. DNA를 competent cell에 넣고 tube를 4~5번 기울이거나 가볍게 손끝으로 쳐서 부드럽게 섞는다.

* DNA 용액은 competent cell 부피의 5%를 넘지 않는 것이 좋다. 대개 competent cell은 200 μl를 사용하므로 DNA는 10 μl 이하로 조정한다. DNA의 양이 많다고 효율이 점점 증가하지는 않는다.

 

3. 얼음에 30분 동안 둔다.

4. 42°C 에서 90초간 heat shock을 준다.

5. 얼음에 2～3분 두었다가 LB 또는 SOC 배지 (SOB 배지에 20 mM glucose 함유) 800 μl를 넣고 잘 섞은 후, 37°C 에서 45분간 배양한다. Rock table을 사용하여 흔들어 주는 것도 좋다.

 

6. 미리 37°C에 두었던 LB (with ampicillin) plate에 위 혼합액을 적당량 pipette으로 떨어뜨린 후, 밀대로 골고루 펴준다.

* LacZ 유전자를 이용한 color selection을 하는 경우, 배지에 isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG)와 X-gal을 첨가해주어야 한다. X-gal(50 mg/ml) 20~40 μl와 IPTG(839 mM) 5~10 μl를 미세원침관에서 섞어 배지위에 떨어뜨리고 밀대로 골고루 펴주면 되는데, 37°C에 적어도 10분 두었다가 박테리아를 도말하도록 한다. X-gal은 50 mg/ml의 농도로 dimethylformamide(DMF)에 녹여 빛이 차단된 용기에 담아 -20°C에 보관하고, IPTG는 2 g을 증류수에 녹여 10 ml 까지 채운다음 0.22 μm-filter하여 1 ml씩 나누어 -20°C에 보관한다.

 

* 위에서 만들어진 혼합액은 대략 1 ml 정도가 된다. 이 혼합액을 모두 plate에 떨어 뜨리고 밀면 잘 밀리지도 않고 물이 흘러 배양도 잘 되지 않는다. 그러므로 이 혼합액에서 적당량의 액체를 제거하는 방법으로 다음과 같은 방법을 쓴다.

1) 과정 5까지 끝낸 균 용액을 10,000 rpm에서 15초간 원심 분리한다.

2) 상층액을 약 850 μl 정도 버린다.

3) 나머지 150 μl로 침전물을 부유시키고, 이를 plate에 도말한다.

 

* 대부분의 경우 vector와 insert를 ligation한 DNA로 형질전환할 경우, 위와 같이 하면 colony들이 잘 분리되는 정도로 배양된다. 그러나 self ligation의 경우에는 colony가 너무 많이 생겨 colony들끼리 잘 분리되지 않는다. Double stranded circular DNA를 쓰는 경우에는 더욱 그러하므로, 위 과정을 경험적으로 조금씩 바꾸어 실험해야 할 것이다. 자신이 없는 경우는 균 혼합액을 10 μl, 100 μl, 나머지 용액 이렇게 나누어 도말해 보면 된다.

 

7. 37°C 배양기에서 plate를 뒤집어서 밤새 배양한다. 12～16시간이면 colony를 관찰할 수 있다.

 

흡광도를 이용한 세균의 성장곡선 측정

 

1. 실험 목적

세균을 액체배지에 배양할 때 성장곡선을 측정하기 위하여 평판배지에서 콜로니숫자를 측정하는 콜로니계수법으로 세균의 숫자를 측정한다. 대량 배양할 때나 실험하는 샘플의 숫자가 많은 경우에는 배양액의 흡광도를 측정함으로써 세균의 생장을 측정할 수 있다. 이번 실험에서는 배양액에서 세균의 생장곡선을 흡광도 측정방법으로 조사한다.

 

2. 실험 원리

이 방법은 세균의 배양액에 일정한 파장의 빛을 통과시켰을 때 용액은 그 빛을 흡수 또는 산란시킬 수 있고 이 때 흡수된 빛의 양은 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 것이다. <그림1>은 흡광도계에서의 빛의 경로를 표시한 것이다. 전구에서 나온 백색광은 회절격자(Diffraction grating)에 의해서 일정한 파장 순서의 스펙트럼으로 배열되므로 파장조절장치를 이용하여 우리가 원하는 단일파장의 빛을 시료에 투사시킬 수 있다. 시료를 투사한 빛은 광전관(Phototube)을 거쳐서 검류계(Galvanometer)에 백분율로 표시할 수 있게 된다. 이때 투과된 빛의 양은 시료의 균체수에 반비례하게 된다. 따라서 여러 가지 비율로 희석된 배양액의 흡광도(Optical Density, OD)를 잰 다음 각 흡광도에서의 정확한 세표수를 알아내어 이들의 상관관계를 구해놓으면 흡광도 측정만으로도 미지의 균체수를 알아낼 수 있다.

 

 

3. 실험 재료 및 방법

▣ 재 료

․균주 : Escherichia coli 배양액(6시간 이상 배양)

․배지 : LB broth 배지, LB agar 배지(LB broth 배지에 Agar 15g/ℓ첨가)

․기구 및 시약 :분광 광도계,

무균대, 멸균된 피펫, 멸균된 희석용 시험관, 멸균된 증류수

 

▣ 과 정

(1) 멸균된 상태의 배지 100㎖에 E. coli 배양액 1㎖을 접종하여 키운다. (37℃, 200 rpm)

(2) 접종 후 4시간동안 0 time을 포함하여 매 30분마다 시료를 무균조작 방법으로 채취하여 다음과 같이 흡광도 측정을 수행한다. 시간별로 시료를 채취하여 흡광도(파장은 595nm 또는 600nm)를 잰다. 0 time에서의 OD600은 0.08～0.1로 출발하는 것이 적당하다. 배양시간에 따른 흡광도의 변화를 그래프용지를 사용하여 그려보고 이로부터 대수기에서의 Generation time을 간접적으로 구해본다. Generation time은 흠광도의 변화가 2배로 될 때까지 걸리는 시간이다.

4. 실험수행상 주의 할 점

(1) 시간별로 시료를 채취할 때 무균조작 하도록 하고 채취가 끝난 배지는 바로 배양 기에 넣어 시간을 지체하지 않도록 한다.

(2) 분광광도계(Spectrophotometer)를 사용할 때는 충분히 예열을 해야 하며 반드시 멸균된 동일 배지로 0점 조정을 한 후 사용한다.

 

5. 고찰

(1) 배양시간에 따라 세균의 변화를 반대수(Semi-log) 그래프 용지에 그려보고 Generation time(GT)을 직접 구해본다.

GT = t log2/ (logA-logB)

여기서 B = 대수생장기에서 한 시점에서의 세균수

A = 대수생장기에서 두번째 시점에서의 세균수

t = A, B 두 지점사이의 시간

 

(2) 흡광도 측정 및 콜로니 계수법의 두 가지 방법으로 구한 Generation time을 비교해보고, 또 대수기에서의 흡광도와 균체수의 상관관계를 알아보자. (E. coli에서는 OD600 = 1일때 약 0.8 x 109 cells/ml을 나타낸다.)

 

세균 수 측정(Bacterial Population Count)

 

1. 실험의 배경과 목적

 

일정한 체적의 물질 내에 세균이 얼마나 오염되어 있는가를 알아보는 방법에는 여러 가지가 있다. 예컨대 우유에 오염된 세균수를 알아보려면 일정량의 우유를 슬라이드에 도말하여 현미경으로 직접 세어보거나, 혈구 계산에 흔히 쓰이는 혈구계수기(hemacytometer)로써 세균수를 세어 전체 용적의 세균수를 계산하는 방법도 있다. 그러나 위와 같은 방법은 표본에 세균수가 비교적 적은 경우에 적용하는 방법들인 것이다. 본 실험에서는 폐수, 우유, 식료품 등 어떠한 물질이든 간에 세균수 측정에 흔히 사용하는 두가지 방법에 대하여 자세히 알아 보기로 하자.

 

2. 실험재료 및 방법

 

1) 정량 평판법(Quantitative plating Method, Standard Plate Count)

표준 평판법(S.C.P)라고도 하며 그림 1 처럼 일정량의 멸균수를 주입한 희석병에 표본을 일정한 비율로 희석하여 한천배지의 평판에 접종하는 방법이다.

그림 1과 같이 샘플에서 1㎖을 취하여 멸균수 99㎖이 든 희석병 A에 접종하면 표본 원액은 100배로 희석된 셈이다. A 희석병에 1㎖을 정확히 따서 B의 99 ml에 접종하면 10,000배로 희석되며, 그와 같은 방법을 희석병 C에 적용하면 1,000,000배 희석된 셈이다. 그런데 표본 원액에 세균이 얼마나 존재하는지를 알지 못하므로 희석병 B와 C로부터 각각 0.1㎖와 1.0㎖씩 희석된 표본액을 따서 한천배지의 평판에 접종시키게 된다. 왜냐하면 희석병에서는 균체수가 지나치게 희석되므로 인하여 한천평판위에 콜로니를 형성치 못할 경우가 있을 것이며 또 어떤 경우는 희석병 B의 경우에도 균체수가 아직도 너무 많이 존재할 경우도 있을 것이므로 적어도 B와 C의 희석병에서 희석수를 따서 접종함으로써 실험결과를 상호 보완할 수 있을 것이다.

▣ 재 료

E.coli의 액체배양체,

nutrient agar,

멸균된 페트리 접시 다수, 멸균된 피펫 다수,

99㎖의 멸균수를 담은 마개달린 희석병(dilution blank)3개

 

▣ 과 정

① nutrient agar를 액화하여 50℃ 정도로 식히고 항온수조에 넣고 99㎖의 멸균수가 긴

희석병에 각각 A,B,C로 표시하고, 또한 멸균된 페트리 접시의 밑바닥에

1:10,000 , 1: 100,000 , 1: 1,000,000 및 1:10,000,000으로 표시하여 놓는다.

② E.coli의 배양체를 잘 흔들어 멸균된 1.1㎖피펫으로 1㎖의 세균용액을 따서 희석병에

접종한다.

③ 희석병 A를 마개를 닫은 채로 25회 정도로 흔들어서 균체덩어리를 분리되게 한다.

④ 멸균 피펫으로(1.1㎖)희석병 A에서 1㎖을 취하여 희석병 B에 접종하고 25회 흔들어

준 후 역시 동일한 과정을 거쳐서 희석병 B와 C에 접종한다.

⑤ 희석병 B를 25회 흔들고 멸균 피펫으로 1㎖을 취하여 1:10,000으로 표시한 페트리

접시에 0.1㎖을 취하여 1:100,000으로 표시한 페트리 접시에, 0.1㎖을 취해 1:10,000,000의 페트리 접시에 접종한다.

⑥ 50℃의 nutrient agar 배지를 이미 표시해 놓은 페트리 접시에 주입하고 조심스럽게

흔들어 주어서 배지와 접종 세균이 잘 섞이도록 해 준다.

⑦ 배지가 완전히 굳으면 35℃의 항온기에 페트리 접시를 거꾸로 넣어서 48시간 배양한

다.

 

 

*세균수의 측정과 계산

 

colony counter를 사용하면 측정에 편리하나 이러한 기구가 없으면 마커펜으로 페

트리 접시의 앞 또는 뒷면을 4분원체, 콜로니가 너무 많으면 8분원체로 금을 그어 놓고 해

부 현미경을 통하여 관찰할 수도 있다.

 

① 48시간 배양한 페트리 접시를 꺼내어 희석된 순서대로 놓고 비교하여 본다. 그리고 나타난 콜로니의 수가 30보다는 많고 300보다는 적은 것이 어느 것인가를 대략 확인해 보라.

30이하 또는 300이상의 콜로니를 가지는 페트리 접시는 세균수 측정에 오류가 생길 가능성이 많다.

② 적당한 페트리 접시를 Quebec콜로니 계수기에 올려 놓고 확대경을 통하여 크고 작은 모든 콜로니를 계수기를 가지고 셈한다.

③ 콜로니의 수를 1㎖당 세균수로 계산한다. 즉, 1:1,000,000배로 희석하여 접종한 페트리 접시에서 220개의 콜로니를 측정했다면,

220 × 1,000,000= 220,000,000 세균/1㎖

으로 계산할 수 있다. 단 2개의 유리수를 사용함이 바람직하다. 예컨대 227 개의 콜로니를 측정했다면 230,000,000 세균/1㎖로 표시하는 것이다.

2) 탁도 측정법(Turbidimeteric Determination)

 

세균수를 측정해야 할 표본이 과다할 경우에 정량 평판법을 통하여 측정하는 것은

여러 모로 힘든 경우가 많다. 예컨대 수많은 유리 기구라든가, 상당량의 배지, 이에 따르는

세척, 준비 등 시간적으로도 감당하기 어려운 경우가 있으므로 흔히 표본의 세균들을 배양

하여 배양액의 탁도(turbidity)를 측정하는 방법을 택하고 있다. 탁도를 측정하는 것은 흔히

흡광도(spectrophotometer)를 사용하는데 이는 세균배양액 내에서 세균들이 마치 교질용액

의 적은 입자처럼 존재하면서 어느 범위내의 광선을 흡수하는 원리를 응용하고 있다. 즉 세

균 배양액의 농도에 따라서 광흡수는 비례함을 나타내 주고 있다. 그러나 균체의 탁도를 세

균수로 확인하기 위해서는 흔히 표준 평판법을 병행하여 사용하기도 한다.

 

 

실험보고서 A. 정량평판법

 

1. 어느 plate가 측정하기 좋도록 희석이 되었는가?

2. 그 곳에는 어느 정도의 콜로니가 있었는가?

3. 배양시 1㎖당 얼마나 많은 균이 존재했는가?

 

미생물 배지의 준비

 

1. 실험 배경과 목적

 

세균배양에 필요한 배지는 배양하고자하는 미생물의 종류에 따라 적합한 것을 선택하여 사용하여야 한다. 따라서 미생물의 종류에 따라 배지의 제법이 다소 달라질 수 있다. 여기서는 배지를 준비할 때 기본적인 주의점과 멸균법 및 평판배지, 사면배지 준비법을 살펴보고, 세균배양에 가장 많이 쓰이는 영양배지의 제법을 실습하도록 한다.

 

1) 배양배지의 준비

 

배지를 만들 때는 그 조성에 따라 필요한 내용물을 저울 등으로 담아 용기에 담고 혼합하여 물을 가한 후 멸균하는데, 세균배양에 필요한 다양한 배지들이 조성대로 이미 만들어져 탈수시킨 상태(dehydracted media)로 시판되는 종류도 많다. 탈수배지는 정해진 농도로 물을 가한 후, 멸균하여 사용하면 된다. 일반적으로 배지를 만들 때는 다음 사항을 지켜야 한다.

 

① 배지를 담을 유리용기는 가능하면 깨끗한 것으로 경질유리제품 (pyrex)을 이용한다. ② 특별히 언급한 경우가 아니면 증류수를 사용한다.

③ 배지 내용물을 정확히 달아 언급한 순서대로 첨가한다.

배지의 pH는 미생물의 생장 에 의해 변화된다. 따라서 필요할 경우 배지 준비시 pH측정기나 pH 지시종이로 재고 지정한대로 배지의 pH를 맟추도록 한다. 대개의 배지는 그 구성성분이 완충능을 갖도록 되어있으나, 필요한 경우 제조시 산이나 알칼리를 첨가하여 pH를 보정해 주어야 한다.

④ 물에 녹인 배지는 특별히 불용성 물질이 함유된 경우를 제외하고는 맑아야하며, 배지 가 맑아야만 접종 후 균체의 생장여부를 쉽게 판독할 수 있다. 따라서, 배지를 맑게 하기 위해서는 여과지 등으로 직접 여과시키거나, 계란의 흰자(egg white)를 가한 후 가열하면 녹지 않은 입자들이 계란 흰자와 함께 응어리로 뭉쳐지는데, 이를 여과하여 맑게 만들기도 한다. 여과시 배지의 양이 적은 것은 여과지로 (Whatman No. 1) 거르 고, 양이 많을 경우에는 두꺼운 펼프층이나, 목화솜 등을 Buchner funnel에 진공펌프 를 이용하여 여과시키도록 한다. 이런 연후에 구멍크기가 작은 여과지로 걸러 모든 현탁입자를 제거시킨다.

⑤ 배양배지는 멸균 전에 사용하기 편리한 양만큼 솜마개, 금속마개 또는 나선형 뚜껑이 덮힌 시험관이나 플라스크에 나누어 담는다.

 

2) 배지 멸균시의 일반적인 유의사항

 

배지는 일반적으로 고압증기멸균기(autoclave)를 사용하여 121℃(101.3kpa 또는 15 p.s.i)에서 15분정도 멸균하나 멸균시간은 용기의 종류나 배지의 양에 따라 다르다. 멸균시간은 정확히 측정하여 결정하도록 한다. 왜냐하면 너무 가열되면 대부분의 배지성분이 손상되기 때문이다. 또한 배지 멸균시 솜마게는 종이나 알루미늄 박으로 싸서 너무 젖지 않도록 하고, 나선형 뚜껑등은 약간 느슨하게 닫아서 가열에 의한 팽창 때문에 깨지지 않도록 하고, 멸균후에 꺼내어 꽉 잠그도록 한다.

열에 약한 배지 (또는 배지 성분)는 여과하거나 변형된 열처리법으로 멸균하되 초기에 배지를 만들 때 오염되지 않도록 무균조작에 신경쓰도록 한다. 주로 열에 약한 성분은 여과하고, 열에 안정한 성분은 별도로 습윤멸균한 후 무균적으로 둘을 섞어 사용한다.

 

3) 탄수화물의 멸균과정

 

일반적으로 가능하면 고농도의 용액을 여과하여 사용한다. 탄수화물의 종류에 따라 다음의 방법으로도 멸균가능하다.

① Tydalization : 하루간격으로 3일동안 100℃에서 30분간 끓인다. 주로 adonitol, arabinose, inositol, raffinose, rhamnose, sorbitol, trehalose.

② 35kpa(약 5.2 p.s.i)에서 25분간 습윤멸균 : aesculin, fructose, glucose, glycerol, lactose, mannitol, salicin, sucrose 등

③ 여과법으로만 사용할 것 : inulin, maltose, xylose.

 

열에 안정한 배지성분은 모두 물에 녹여 따로 습윤멸균한 후, 위와 같이 따로 멸균한 탄수화물을 무균적으로 첨가한다. 이 경우 곧바로 사용하지 말고 37℃에서 하루밤 방치하여 멸균여부를 확인한후 사용하도록 하고, 특정당의 이용하는데 사용하고자 할 때는 그 배지에서 확실히 생장하는 것으로 알려진 표준 균주를 배양했을 대 양성반응이 나타나는지 확인한 후에 사용하도록 함이 현명하다.

 

④ 보관법 : 나선뚜껑 시험관에 든 배지는 직사광선을 피하여 상온에서 보관한다. 이 용기는 배지의 증발을 방지하여 보관시 배지의 건조를 방지하는 이점이 있다. 솜마개 또는 금속마개를 한 시험관이나 플라스크는 4℃에 보관하도록 한다.

 

4) 고체 평판 및 사면배지의 준비법

 

고체배지는 다량준비하여 멸균하고 (미리 멸균하여 둔 것은 사용직전에 고압증기 처리하거나 끓여서 녹이고) 50℃로 식힌 후, 열에 약한 혈액, 항생제, 당, 아미노산등은 역시 45℃정도로 맞추어 첨가하되 거품이 일지 않도록 용기를 조심스럽게 흔들어 혼합한다. 그런 다음 멸균된 페트리 접시나 용기에 나누어 붓는다.

 

① 페트리접시에 붓는 법 : 멸균된 페트리 접시를 바닥이 평평한 곳에 준비해 두고 45～50℃로 식힌 배지가 든 플라스크의 입구를 불꽃으로 살균한 다음, 페트리접시의 뚜껑을 열고 15㎖ 정도씩 붓는다. 이때 오염이 되지 않도록 주의하고 배지를 부은 페트리접시는 배지가 굳을 때까지 움직이지 않도록 한다. 굳은 고체 평판배지는 비닐막 등으로 잘 싸서 4℃에 보관하도록 하며, 사용 전에 잘 말려서 사용하도록 한다. 한천배지의 표면에 물기가 있으면 콜로니가 명확히 구분되지 않게 되어 단일 콜로니의 선별이 어렵다. 4℃에서 며칠간 보관한 경우는 건조시간이 단축되거나, 따로 건조시킬 필요가 없는데, 필요할 경우 37℃에서 하룻밤 방치하여 배지를 말리도록 한다. 이 과정은 건조와 동시에 배지의 오염여부를 확인할 수 있는 장점이 있다.

 

② 사면배지 준비법 : 물에 녹인 배지를 중탕하여 잘 녹인 후 약 5㎖씩 (시험관의 크기에 따라 양을 조절한다) 나누어 담고 마개한 후, 습윤멸균한다. 멸균이 끝난 후 배지를 비스듬히 기울여(30-40도 정도) 굳힌다. 이 때 사면배지가 너무 경사지거나 배지량이 많아서 시험관 입구 가까이에 도달하지 않도록 주의한다. 대개 시험관의 ½정도로 한다. 필요에 따라 접종침을 찔러 접종할 경우에는 약 7㎖의 배지를 붓고 바로 세워서 굳히도록 한다. 사면배지 역시 4℃에서 보관하도록 한다.

2. 실험 재료 및 방법

 

▣ 재 료

한천(agar), 효모추출물(yeast extract), tryptone, NaCl,

2ℓ짜리 삼각플라스크 혹은 비이커,

500㎖짜리 삼각플라스크, 500㎖짜리 눈금 실린더,

솜, 마개,

pH측정기, 저울, 1N HCl, 1N NaOH, 멸균기

시약용 숟갈, 유산지, 증류수가 들어 있는 비이커 (또는 세척병)

 

▣ 과 정

① 2ℓ플라스크에 증류수 500㎖을 붓는다.

 

② tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g 을 플라스크에 달아 넣는다. 이때 유산지 를 천칭위에 올려놓고, 증류수로 잘 씻은 시약용 숟갈을 휴지로 닦아 물기를 완전히 제거하여, 시약을 달도록 한다. 한 시약을 달고 난 후 에는 숟갈을 꼭 세척하도록 하 며, 부주의하여 시약통의 시약이 다른 시약에 의해 오염되지 않도록 주의한다. 또한 천칭에 시약을 흘리지 않도록 주의하며, 흘린 경우에는 즉시 닦아내도록 한다.

 

③ 플라스크를 잘 흔들어 내용물을 다 녹인다. 증류수를 가하여 전체량이 1ℓ가 되도록 한다.

 

④ 위 용액을 500㎖ 플라스크에 250㎖씩 나누어 담고 다음과 같이 한다. 첫 번째 배지에는 더 이상 배지성분을 첨가하지 않고 액체배지로 사용하고, 두 번째 배지에는 한천 3.75g (고체배지를 만들 때는 한천을 배지 1 리터당 15g을 첨가)을 가하고 흔들 어준 다음, 5분쯤후에 중탕하여 녹이되, 가끔 흔들어 준다. 이렇게 만든 것이 영양한 천배지이다.

 

⑤ 위의 네 가지 배지를 pH측정기(또는 pH 측정용종이)로 1N HCl이나 1N NaOH를 가 하여 pH 7.0 으로 맞춘다. 사용 후 pH 전극(electrode)은 잘 세척한다.

 

⑥ 시험관에 각각 나누어 담고 마개를 한 후 습윤멸균을 121℃(15 p.s.i)에서 15～20분 멸균한다.

 

⑦ 멸균이 끝나면 사면배지 만들어 놓은 것은 기울여 눕혀 사면배지를 만들고, 식혀서 4℃에 보관한다.

 

3. 실험수행상 주의 할 점

영양배지 등 영양소가 풍부한 배지에 포도당을 첨가할 때는 일반적으로 다른 배지성분과 함께 녹여 습윤멸균 하기도하며, 멸균시간을 10분 내외로 단축하기도 한다. 그러나 생장율 측정또는 생리적 특성 조사용 배지를 만들 때는 앞서 살펴본 바와 같이 여과하여 멸균한 높은 농도의 포도당 저장용액을 만들어두고 50℃정도로 식힌 배지에 첨가하도록 한다.

배지 만드는 법


오늘은 LB media 와 LA media, 그리고 LB plate와 LA plate를 만들어 보았습니다.

LB media 와 LA media는 액체 배지, 그리고 LB plate와 LA plate는 고체배지인데요
이 둘의 차이는 고형화 물질의 유무입니다.
대체로, 고형화를 위해서는 Agar를 사용합니다.

파우더 형태의 시약을 사용할때는 전자저울로 필요한 양을 측정하여 사용합니다.
이때, 시약을 올려놓을 종이를 올려 놓은후, 꼭 영점조절을 해 줍니다.

종이의 무게는 0.26g이네요

 0점 조절 버튼을 누르면 무게가 0에서 시작해 순수한 시약의 무게만 측정 할 수가 있게 되죠^.^

LB배지와 LA배지의 차이는 Amp가 들어갔느냐 아니냐의 차이입니다.
엠피실린이 들어가면 LA배지가 됩니다.

엠피실린의 무게를 잴 때는
Chemi-balance라고 불리는 일반 전자저울보다 더 정밀한 저울을 사용합니다.

엠피실린은 온도에 민감하기때문에 autoclave를 사용한 멸균을 할 수 없습니다.
그렇기때문에 나중에 멸균까지 끝마친 LB 배지에 따로 추가를 해 주어야 합니다.
이떄 멸균된 엠피실린을 넣어주기위해서, 이 멸균을 위해서는 여과멸균법을 사용합니다 

멸균된 엠피실린을 씐나게 볼텍서로 섞어줍니다^.^

이후, 만들어진 엠피실린은 conical tube라고 불리는 고깔모양의 작은 시험관 튜브로 옮겨줍니다

한편, 따로 만들고 있던 배지들은
Autoclave에서 멸균후,
항온수조로 옮겨서 보관해줍니다.

그러는 동안 페트리 접시 바닥부분에 배지 종류, 날짜, 조이름을 적어줍니다.

이 작업은 클린벤치 안에서 진행하는데요,
클린벤치사용전에는 양손과 클린벤치 안에서 쓸 모든것을 소독한후 가지고 들어가서 작업합니다. 

배지를 옮겨 담을 페트리 접시들을 정리 준비 해 주고,

항온수조에서 꺼내온 LB배지가 담긴 플라스크의 입구부분을 알코올 램프의 불꽃을 이용해 멸균해줍니다.
이 과정은 클린벤치 안에서 모든 시험관의 뚜껑을 여닫을떄마다 매번 진행해 주어야 하며,
Flaming 이라고 불립니다.

옆에 옹기종기 모여있는 엠피실린들이 보이네요
우선 250ml만큼씩 500ml의 LBplate배지를 시험관 튜브에 옮겨줍니다.
나중에 이 시험관에 엠피실린을 추가해 LA plate배지를 만들게 됩니다

시험관 튜브에 옮긴 후 남은 LBplate를 라벨링을 마친 페트리접시로 옮겨줍니다

원래는 뚜껑을 아주 살짝만 열고 진행해야하는데 씬나게 활짝 열었군요ㅠㅠ
무튼, LB plate가 네개 만들어 졌습니다.

이제 LA plate배지를 만들기 위해 Amp를 추가해줄 차례입니다.
마이크로 파이펫으로 필요량을 따서 시험관 튜브로 옮겨줍니다

inverting이라고 불리는 과정입니다.
엠피실린을 잘 섞여 들어가게 하기위한 과정으로써, 마구잡이로 흔들어주는것이 아닌, 위아래로 천천히 뒤집으며 섞는 방법입니다.
섞을때 막 섞어주면 거품이 생겨 좋지않은 배지가 만들어 지기때문에, 꼭 inverting이라는 방법으로 섞어주어야 합니다.

또 뚜껑을 신나게 열어 재꼈내요
하지만 뚜껑은 살짝만 열어서 부어주는게 올바른 방법입니다.


이로써 LA plate배지도 네개가 만들어 졌습니다.



아주 기초적인 내용이지만
이제 막 전공공부를 시작하는 학부생에게는 너무나도 기억해야할것들이 많은 과정들이었습니다 @.@

LB media 와 LA media만들기는 2탄에서 진행됩니다^.^ 

유기화학 4판 솔루션입니다

Organic Chem_chapter7.pdf

 

Organic Chem_chapter6.pdf

 

Organic Chem_chapter5.pdf

 

Organic Chem_chapter4.pdf

 

Organic Chem_chapter3.pdf

 

Organic Chem_chapter2.pdf

 

Organic Chem_chapter1.pdf