한 세균으로부터 나온 유래한 DNA를 다른 세균이 받아들임으로써 유전형질이 전환되는 유전자 전달방식인데 Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Bacillussubtilis, Streptococcus sanguis, Neisseria gonorrhoeae, Acinetobacter calcoaceticus에서 잘 연구된 바 있으나, 요즈음은 유전자조작 기술의 발달과 더불어 여러 종류의 세균에서 적용되고 있다. 그런데 어떤 세포에서의 형질전환 과정이 자연적인 과정의 하나로 이루어지기 위해서는 유전자 수용세균이 배지내에 있는 DNA를 세포내로 수용할 수 있는 상태(competent)에 있어야 한다. 또한 접합실험과 마찬가지로 유전자 공여체와 수용세균이 서로 다른 유전형질을 가지고 있어야만 형질전환체(transformant)의 선별이 가능하다.
유전자 공여체로 바이러스 DNA를 사용하는 경우를 특별히 transfection이라고 한다. 여기서는 이미 추출한 플라스미드 DNA로 형질전환시키는 방법 중 가장 많이 이용되는 Mandel 과 Higa(1970)의 CaCl2처리법을 살펴보자.
․형질전환률을 최대로 하기 위해서는 대수기(exponential phase)의 세균을 사용하고,
CaCl2 처리시에는 세균 밀도가 낮은 것이 좋다.
또한 ⑤과정에서와 같이 4℃에서 12 - 24시간보존한 후 DNA와 반응시키면 형질전환 률이 4 - 6배 증가하나, 24시간을 경과하면 감소함에 유의할 것.
․Amp 내성 형질전환체를 선별하고자 할 때는 평판배지 당 세균의 밀도가 낮게 접종하고 배양 16 - 24시간 후에는 4℃에 보관하도록 한다. 왜냐하면 내성균이 분비하는 배지내의 β-lactramaserk 확산되어 콜로니주변 배지의 Amp이 분해되어 접종 밀도가 높거나, 배양 시간이 길면 Amp 감수성 균도 자랄 수 있게 되게 때문이다.
실험보고서
[결과]
형질전환률을 다음에 의거하여 구하라.
형질전환률 = 형질전환체의 수/플라스미드 DNA랑(㎍)
[물음]
1. 형질전환시 플라스미드 DNA의 농도가 높고, 가하는 DNA용액의 부피가 크면 형질전환률이 떨어지는 이유를 생각해 보라.
2. CaCl2 처리의 목적을 살펴보고, 이와 동일한 효과를 내는 처리법들이 (즉 DNA가 세균 세포내로 도입되도록 도와주는 방법)어떠한 것이 있는가 살펴보자.
전기영동(Electrophoresis)이란 특이한 매질 (agarose나 acrylamide)을 이용하여 DNA나 단백질 등의 고분자 물질을 분리하는 방법이다. Agarose에 DNA를 넣고 전기를 걸어주면 DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠므로 매질을 타고 양전하 방향으로 움직이게 된다. 이 때 DNA의 움직이는 속도는 DNA의 크기, 형태 (선형, 원형 등)에 따라 다르므로 매질 내에서 그 특성에 따라 분리되어 진다.
본 실험에서는 제한 효소로 자른 plasmid DNA (특별한 구조를 지니지 않은 선형 DNA)와 제한효소를 처리하지 않은 원형 DNA (superhelical 구조를 지님)를 agarose gel 상에서 직접 전기영동하고 이를 ethidium bromide로 염색 후에 자외선을 이용해 눈으로 직접 확인해 봄으로서 DNA 전기영동의 원리와 과정들에 대해 이해해 보고자 한다.
3. 재료 및 실험 기구 및 기기
agarose powder2 g
1X TBE (Tris-borate buffer) 용액 200 ml X 8조
5 X Gel loading dye 용액 100 ul
10 mg/ml ethdium bromide 용액 100 ul
agarose gel caster 8 대
전기영동 장치 (chamber 및 power supply) 4 대
DNA sample (1 kb ladder, pBlueScript plamsid DNA) 각 20 ug
lambda pippetman and yellow tip8 개
삼각 플라스크8 개
전자렌지 또는 전열기1 대
UV transilluminator, 사진기, balance1 대
Mass cycliner1 개
* 4명 1조, 8조를 기준으로 작성
4. 실험 방법
4-1. agarose gel 만들기
1) 2 liter의 1X TAE buffer 용액 (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA)을 먼저 만든다. 5X TAE buffer 용액 400 ml에 증류수를 첨가하여 2 liter를 만든다
2) 삼각 플라스크에 1X TAE 용액 25 ml과 0.25 g의 agarose powder를 넣어 전자렌지에서 agarose 입자가 완전히 녹을 때까지 끓여준다.
3) 손으로 댈 수 있을 때 까지 식힌 후에 10 mg/ml의 ethidium bromide 용액을 2 ul 첨가하여 잘 섞은 후에 gel caster에 부어 완전히 굳을 때 까지 기다린다.
4-2. DNA 시료의 준비
Gel이 식는 동안 분석하려는 DNA 샘플 5 ul (300 - 500 ng)당 1 ul의 loading dye를 첨가하여 준비한다. 또한 5 ul의 1kb ladder 마커 (1 ug)에 1 ul loading dye를 섞어 분자의 크기를 알 수 있는 표준 샘플도 준비한다.
* loading dye는 50% glycerol에 bromophenol blue를 섞은 것으로 DNA가 gel에 loading될 수 있게 하며 전기영동 동안에 시료의 이동을 확인할 수 있게 한다.
4-3. 시료 주입(sample loading)
1) 완전히 굳은 agarose gel에서 조심히 comb을 제거한 후 gel casting tray를 전기영동 탱크에 넣은 후 TBE buffer 용액를 탱크에 부어 gel이 수면으로부터 1-2 mm정도 잠기게 한다.
2) Well의 가장 왼편에 DNA 마커 샘플을 주입하고, 다음 well부터 샘플 (6ul)을 순서대로 주입한다.
3) 샘플을 다 주입하면, gel tank에 전극을 맞추어 연결한다. [gel의 well쪽이 (-)전극 (검정색) 쪽에 위치, DNA는 (+)전극쪽 (빨강색)으로 이동하게 됨]
4) Loading dye의 이동이 gel의 거의 3/4지점까지 내려갈 때까지 전기영동한다.
4-5. 사진찍기
1) Gel 탱크의 전원을 끄고 gel을 UV transilluminator로 옮긴 후 보호 장치를 하고 UV light를 켠다.
*주의 : UV transilluminator는 노출 시 피부와 눈에 손상을 입히는 단파장의 UV light를 발산하기 때문에, 반드시 비닐장갑이나 보호장구를 착용해야함.
2) Transilluminator 전원을 켜고 gel을 관찰한다. DNA 밴드(orange band)를 확인 후 사진을 찍고 전원을 끈다.
실험보고서
1. 1kb ladder DNA 마커들이 움직인 거리와 그 크기 사이에는 어떤 상관 관계가 있는지 실측하여 공식으로 나타내 보자.
2. Supercoil plasmid DNA 시료에서 보이는 다양한 종류의 DNA들은 각각 어떤 형태이며 이들의 움직임에 차이가 나는 이유는 무엇인가?
1. 실험목적 : DNA를 제한효소로 잘라서 정기영동하여 분석함으로써 제한효소의 특성과 반응을 이해하고 DNA상의 제한효소 지도 (map)를 작성할 수 있는 능력을 기른다.
2. 재료, 실험기구 및 기기 :
Plasmid DNA, DNA size marker,
제한효소와 reaction buffer, 3차 증류수,
eppendorf tubes, micropipetter (20 ㎕, 200 ㎕),
piptet tips, 37℃ water bath,
ice bucket, ice,
microcentrifuge, microwave,
agarose, flask,
미세 저울, ethidium bromide (10 ㎍/ml stock),
6X DNA loading dye, 50X TAE buffer,
agarose 전기영동 시스템과 power supply,
UV box와 사진촬영 시스템
3. 실험 방법 :
DNA를 자르기 위해서는 eppendorf tube에 reaction buffer, DNA 그리고 효소를 같이 넣고 특정온도에서 일정시간동안 반응을 시켜야한다. 먼저 반응을 시키기 전에 자르려고하는 DNA의 양과 reaction volume을 결정해야 한다 (대체적으로 1 ㎕ reaction volume 당 최대 약 100 ng DNA 까지 사용한다). 완전하게 DNA를 자르기 위해서는 효소의 충분한 (3-5배) 활성 단위(unit)로 잘라야한다. 효소 단위
플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chromosomal DNA 로부터 분리하여야 한다. 플라스미드 분리방법은 플라스미드 DNA와 bacterial DNA의 물리적인 차이점에 의해 분리된다. 가장 큰 플라스미드의 길이는 E. coli 의 염색체 길이에 8%밖에 되지 않으며 대부분이 작다.
플라스미드와 bacteria DNA의 구조에 차이로부터 분리하는 방법이 있다. 플라스미드와 염색체는 구형인데 염색체는 extract 시 구형에서 선형조각으로 깨어지며 플라스미드에는 구형으로써 변화가 없다. 이 구조적인 차이점을 이용하여 정제된 플라스미드를 얻을 수 있다.
<분리방법> :Minipreps of plasmid DNA
bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법은 대단히 많지만
성공률과 속도를 생각하여 세 가지 방법으로 소개하면
Alkaline lysis prep, boiling method 그리고 lithium-based procedure 이다.
① Alkaline lysis miniprep
alkaline lysis procedure(Bimboim, Doly, 1979)은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다(여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다). 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며(SDS는 potassium과 화합물을 이룬다) 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.
A. Materials
1.Soln.1 (lysis soln)-autoclave
100ml preparation
50mM Glucose 0.9g
10mM EDTA(pH 8.0) 2ml 0.5M EDTA
25mM Tris.cl(pH 8.0) 25ml 0.1M Tris.cl
D.W Up to 100ml
2.Soln.2 (NaOH/SDS soln)-autoclave, Fersh soln only
20ml preparation
0.2N NaOH 0.16g NaOH
1w/v% SDS 0.2 g SDS
D.W Up to 20ml
Store at r.t,if white granules detected MUST discard!
cf) Quick preparation
Autoclaved 2g/50ml (1N) NaOH 4ml -+
Autoclaved 10w/v% SDS 2ml -+ 40℃에서 녹여서 사용
Autoclaved D.W 16ml -+
3.soln.3 -M(KOAc 3M,pH 4.8)-autoclave
100ml preparation
5M KOAc (94.15g/200ml D.W) 60ml
Glacial HOAc 11.5ml
D.W 28.5ml
4. RNase solution
20mg pancreatic RNase/ml in 10mM Tris HCl(pH 7.5), 15mM NaCl
Heat at 100'C for 15min, and store at -20℃
5. TE buffer
10mM Tris HCl(pH 8.0)
1mM EDTA(pH 8.0)
B. Procedure
1 .Grow cell culture in L broth + Ampicillin(100ug/ml final conc.)overnight.
2. Take 1.0ml cell suspention into 1.5msl Eppendorf tube.Centrifuge 15 seconds in 10,000×g
3. Remove supernatant carefully with fine aspirator
5. Add 100ul Lysis soln. to suspend the pellet and hold at r.t 5min.
cf) 만일 cell culture 가 없고 plate에 긁어 놓은 것이 있으면 이쑤시게를 이용 좁쌀크기로 떠내서 바로 soln.1을 넣은 tube에 넣고 가볍게 vortexing을 실시하여 suspention시킨 것을 이용한다.
6. Add 200ul NaOH/SDS reagent(soln.2) mix and hold on ice bed 5min.
soln.2가 들어가면 투명하게 되며 점도가 높은 것이 ice-bed에 두면 점성이 낮아진다.
7. Add 150ul of KOAc(pH4.8,Soln.3-M),flicking,and store the tube on ice bed 5min.
soln.3가 들어가면 하얗게 되며 ice bed에 두면 점도가 낮아지고
liquid phase와 protein/gDNA phase가 구분되어진다.
8. Add 400ul of PCI(25:24:1),mix and centrifuge 5min.at 15℃
9. Transfer the supernatent to a fresh tube,
Add 500ul 100% EtOH,vortex 10sec, and stay for 5min. at r.t.
10. Centrifuge 5min.at 15oC and discard the supernatent
11. Drain off the EtOH completely and vacuum pump drying 15min.
12. Resuspention the pellet with 20ug/ml RNase contained 43ul D.W or TE buffer.
② Boiling miniprep
Plasmid를 지닌 bacteria는 lysozyme, Triton(a nonionic detergent), 열처리 등으로 깨어질수 있다. chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을 수 있으며 plasmid DNA는 상등액에서 isopropanol(Holmes and Quigley,1981)로 침전시켜 분리할 수 있다. boiling miniprep는 적은 양의 plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만 분리된 plasmid DNA는 alkaline lysis miniprep 보다 quality가 떨어진다.
5. boiling water bath(100℃)에 1∼2 min 정도 tube를 정치한다.
6. 15∼30min정도 원심분리한다.
7. pipet으로 상등액을 새로운 tube에 옮긴다(이때 pellet에 주의하여 옮긴다).
200㎕(상등 액과 같은 양) cold isopropanol에 섞는다.
-20℃에서 15∼30 min 정도 정치한다. 다시 5 min 정도 원심분리한다.
8. 상등액을 제거하고 pellet이 마를 때 까지 진공상태로 정치한다.
9. 50㎕ TE buffer에 pellet을 녹여 보관한다.
③ Lithium miniprep
Plasmid DNA는 평판 또는 액체배지에서 배양되는 E.coli로부터 획득할 수 있는데, Bacterial cells은 Triton X-100/LiCl과 phenol/chloroform을 처리하여야만 한다. 이것은 plasmid DNA의 가용성화와 chromosomal DNA, cellular debris등에 침전을 일으킨다. debris는 원심분리를 통해 제거할 수 있다. 이러한 분리절차로 chromosomal DNA 등을 제외한 plasmid DNA만을 얻을 수 있다.
이번 분리방법은 가장 빠르게 plasmid DNA를 분리하는 방법이며 대부분의 생물학적 적용면에 이용할 수 있는 정제된 plasmid DNA를 분리할 수 있다.
A. Materials
TELT soln.
LB medium(항생제첨가배지)
1:1(w/v) phenol/chloroform
100% ethanol(-20℃보관)
TE buffer
10mg/ml DNase-free RNase A
1.5ml microcentrifuge tubes
B. Procedure
1. 형질전환체 colonies로부터 plasmid DNA를 분리하기 위해 다음과 같이 세포를 준비.
a. microspatula를 이용하여 LB agar plate에 있는 bacterial colony(2∼5mm diameter까지 배양된 colony)을 떼어 100㎕ TELT soln.이 들어있는 1.5-ml microcentrifuge tube에 옮긴다.
b. step 3의 과정을 위해 위의 혼합액을 Vortex하여둔다.
2. 액체배지로부터 plasmid DNA를 분리하기위하여 다음과 같이 세포를 준비하여둔다.
a. 적합한 항생제가 첨가된 1.8ml LB medium에 bacteria colony를 배양한다
(대략 30℃, 18∼24hr까지 진탕배양).
b. 신중히 배양액을 1.5-ml microcentrifuge tube에 옮긴다.
c. 세포를 원심분리(10,000×g, for 20sec)하여 pellet을 형성시킨다.
d. tube를 수직상태로 들고 상등액을 aspirator로 제거한다.
e. 100㎕ TELT soln.을 pellet에 넣고 vortex로 녹인다.
3. 100㎕ 1:1 phenol/chloroform을 첨가하고 5sec 정도 vortex를 한다.
4. 원심분리(15,000×g, for 1min)를 한다.
5. pipettor를 이용하여 신중히 75㎕ upper aqueous phase를 빼내어 새로운 microcentrifuge tube에 옮긴다.
6. 상등액에 150㎕ 100% ethanol(chilled)를 첨가, plasmid DNA가 침전될 수 있도록 섞는다.
3. 10시간 이상 배양한 cell 1.5ml를 eppendrof tube로 옮겨 14,000rpm에서30sec - 1min하거나 15ml culture tube 일경우3,000rpm에서 15-20min
4. 상층액을 버리고, cell pellet에 Solution I를 100 μl 넣고 vortexing 하여 완전히 녹인다.
5. Solution II를 200 μl첨가한 후, tube를 inverting 하여 조심스럽게(5-6회) 섞어준다.
6. Solution III를 150μl 첨가하여 inverting하여 섞어준다.
7. ice에 5min간 놓아둔다.
8. 4°C, 15,000rpm으로 5min centrifuge한 후 상층액을 new eppendrof tube에 옮기고 남아있는 protein을 제거하기 위해 phenol:chloroform(1:1)을 상층액과 동일한 부피로 섞어서 10-15sec vortexing 후 Max.rpm에centrufuge한다.
9. centrifuge한 tube의 상층액을 new tube에 옮긴 후 2-2.5volume의 100% ethanol를 첨가한 후 흔들어준다.
10. 4°C, Max.rpm에centrifuge 10-15min 하면 yellowish white pellet이 생성된다.
11. ethanol을 pellet에 영향을 주지 않고 제거한 후에 spin-down 시키고 상온에서 건조시킨다.
12. 생성된 pellet의 양에 따라 적량의 SDW로 녹인다.
13. miniprep 한DNA 1μl + SDW 49μl로 dilution 시킨 후에 DNA concentration를 Biophotometer로 측정한다.
Plate는 박테리아가 자랄 수 있는 최적의 환경이어야 한다. 박테리아는 plate 상에서 자라 colony를 형성하는데, 한 개의 colony는 한 개의 clone으로부터 자란 것이므로 이를 분획하여 여러 실험에 사용할 수 있게 된다. Plate의 조성은 배양시 사용하는 액체 배지(media)의 조성에 agar를 첨가한 것이다. 이때 첨가하는 agar의 농도는 1.5%이며, top agar와 같은 특수한 용도로 사용하기 위해서는 agar의 농도를 변화시키기도 한다.
실험방법
1. Plate를 만들고자 하는 배지를 만든다. 각 배지의 조성은 다음과 같다.
1) LB 배지 (Luria-Bertani medium) 1 liter
1.1.1.1. bacto-tryptone 10 g
1.1.1.2. bacto-yeast extract 5 g
1.1.1.3. NaCl 10 g
1.1.1.4. * 실험실에서 가장 흔히 사용되는 배지이다. 위 성분 950 ml의 증류수에 녹인 후 pH를 7로 맞추기 위해 5 N NaOH를 첨가(약 200 μl)하고 증류수로 1 liter로 채운다음 autoclave한다.
2) TB 배지 (Terrific Broth) 1 liter
1.1.1.5. bacto-tryptone 12 g
1.1.1.6. bacto-yeast extract 24 g
1.1.1.7. glycerol 4 ml
1.1.1.8. * Glycerol이 첨가되어 균을 단시간에 대단히 높은 농도로 배양할 수 있는 배지이다. 900 ml의 증류수에 녹인 후 autoclave한다. 사용하기 직전에 phosphate buffer(0.17 M KH2PO4, 0.72 M K2HPO4)를 100 ml 첨가한 후 사용한다. Phosphate buffer는 90 ml 증류수에 2.31 g의 KH2PO4와 12.54 g의 K2HPO4을 잘 녹인 후 증류수로 100 ml 까지 채우고 멸균하여 사용한다.
3) SOB 배지1 liter
1.1.1.9. bacto-tryptone 20 g
1.1.1.10. bacto-yeast extract 5 g
1.1.1.11. NaCl 0.5 g
1.1.1.12. * Competent cell 제조시에 사용하는 배지이다. 950 ml의 증류수에 녹인 후 250 mM KCl 10 ml를 첨가하고 5 N NaOH를 이용하여 pH를 7로 맞춘 다음 증류수로 1 liter까지 채우고 autoclave한다. 사용하기 직전에 멸균한 2 M MgCl2를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하여 사용한다.
4) SOC 배지 (Terrific Broth)
* 20 mM의 MgCl2가 함유된 SOB 배지에 20 mM glucose가 첨가된 배지이다. 1 M glucose 용액은 100 ml에 18 g의 glucose를 녹여 0.22 μm-pore의 filter를 통과시켜 사용한다. 박테리아의 형질전환시에 사용한다.
5) M9 Minimal 배지 1 liter
1.1.1.13. Na2HPO4-7H2O 6 g
1.1.1.14. KH2PO4 3 g
1.1.1.15. NaCl 0.5 g
1.1.1.16. NH4Cl 1 g
1.1.1.17. * M13 phage의 cloning 시에 사용할 수 있다. M9 plate를 제조하는경우는 agar 첨가 후 멸균한 배지가 적당히 식었을 때 다음과 같은 것들을 넣어준 다음 plate를 만들어야 한다.
1.1.1.18. 20% glucose (filtered) 10 ml
1.1.1.19. 0.1 M CaCl2 (autoclaved) 1 ml
1.1.1.20. 1 M MgSO4 (autoclaved) 1 ml
1.1.1.21. 100 mg/ml Thiamine (filtered) 50 ml
6) Brain infusion 배지 (Penassay 배지) 1 liter
1.1.1.22. 0.15% beef extract
1.1.1.23. 0.15% yeast extract
1.1.1.24. 0.5% peptone
1.1.1.25. 0.1% glucose
1.1.1.26. 0.35% NaCl
1.1.1.27. 0.37% K2HPO4
1.1.1.28. 0.13% KH2PO4
* 시약상에서 혼합된 가루를 판매하므로 1 liter를 제조하기 위해 37 g을 혼합하여 사용한다.
2. 위의 배지는 액체로 사용하기도 하는데, 이를 이용한 plate를 만드는 경우 autoclave를 하기 전에최종농도 1.5%가 되도록 agar powder(15 g/liter)를 첨가한다.
3. 15 lb/sq로 20분 이상 autoclave한다.
4. 배지가 적당히(65°C 정도) 식을 때까지 기다린 후 필요하면 ampicillin을 60 μg/ml가 되도록 첨가하고 잘 흔들어 섞는다.
* Ampicillin은 가루를 증류수에 녹여 50~100 mg/ml의 농도로 만들고 filter 후 1 ml 씩 분주하여 -20°C에 보관한다.
5. 배지를 petridish에 조심스럽게 붓고 기포가 생기면 달구어진 loop를 이용하여 제거한다. 하루정도 상온에 놓아둔 후 wrap으로 잘 싸서 4°C에 뒤집어서 보관한다.
* 배지의 온도가 너무 높으면 ampicillin의 활성이 떨어지고, 배지가 너무 식으면 plate를 제조하는 도중 배지가 굳을 가능성이 있으므로 적당한 온도에서 작업할 수 있도록 한다.
B. Competent cell의 제조
박테리아를 형질전환(transformation)시키는 대부분의 방법은 수많은 과학자들이 경험적으로 정리한 것이며 그 기전은 정확히 알려지지 않았다. 현재 실험실에서 competent cell을 제조하는 방법으로 다음과 같은 두가지가 주로 사용된다. 첫번째 방법은 fresh frozen 방법으로 DH1, DH5, MM294등의 E. coli를 높은 효율(5 ×108 transformed colonies/μg of supercoiled DNA)로 형질전환시킬 수 있으며, strain에 따라서 효율이 떨어지기도 하지만 사실상 거의 모든 경우에 사용할 수 있는 방법이다. 보다 간단한 방법인 두번째 방법은 calcium chloride를 이용하며 대략 107 transformed colonies/μg of supercoiled DNA의 효율을 가지고 있다.
1) Fresh 또는 frozen 방법을 이용한 competent cell의 제조
이 방법은 Hanahan(1983)에 의해 개발된 방법으로 DH1, DH5, MM294등의 strain을 높은 효율로 형질전환할 수 있다. 다른 strain에서는 약 5～10배 정도 효율이 떨어지고, MC1061 등은 이 방법으로 형질전환이 되지 않는다. 분주하여 -70°C deep freezer에서 2~3개월간 보관하여도 효율이 별로 감소하지 않는다.
실험방법
1. Agar plate(LB 또는 SOB)에 자란 E.coli DH5α colony를 SOB medium 3 ml(20 mM이 되도록 2 M MgCl2를 30 μl 첨가)에 접종한 후 밤새 키운다. 효율을 증가시키기 위해서는 -70°C deep freezer에 보관한 frozen bacterial stock에서 새로 streak한 plate를 사용하는 것이 좋다.
2. 위에서 자란 균 2 ml를 200 ml의 SOB medium(20 mM이 되도록 2 M MgCl2 를 2 ml 첨가)에 다시 접종한 후 O.D.600이 0.4가 될 때까지 shaking incubator에서 키운다. 보통 약 3～4시간이 소요되며, 약 2시간 이후부터 30분마다 O.D.를 계속 측정해보는 것이 좋다(효율을 증가시키기 위해서 배양된 세균 수가 108 cells/ml를 넘지 않는 것이 좋다). 이론상 E.coli는 최적 조건에서 doubling time이 20분이므로 이에 맞추어 시간을 추정해 볼 수 있으나 배양조건을 고려해야 한다.
3. 배양액을 멸균된 50 ml conical tube 4개에 나누어 넣고 얼음에 10분 방치한다.
4. 4,500 rpm, 4°C에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집은 상태로 약 1분간 놓아둔다.
5. 배양 부피의 1/3(tube당 15 ml) 되는 frozen storage buffer(FSB)에 세포침전물을 부유시킨 다음, 두 tube씩 합쳐서 30 ml 씩으로 만든 후 얼음에 10분 놓아둔다. FSB의 성분은 표 1과 같다.
* 침전된 균을 부유시킬 때 vortex 보다는 pipetting으로 부유시키는 것이 좋은데, 이때 15 ml을 모두 넣고 부유시키려면 잘 되지 않는다. 처음 1~2 ml을 넣고 잘 부유시킨 다음에 15 ml 까지 FSB로 채우고, 잠깐동안 약하게 vortex를 하는 것이 좋은 방법이다.
6. 위와 같이 다시 원심분리한 후 처음 배양 부피의 1/12.5(tube 당 8 ml)되는 FSB에 부유시키고, 두 tube를 합쳐서 16 ml로 만든다.
7. DMSO를 3.5%(V/V)만큼 가한다(560 μl). 이때 DMSO는 세포 부유액의 중앙에 떨어뜨리고 곧바로 tube를 기울이면서 5～10초간 부드럽게 섞도록 한다.
8. 얼음에 5～15분 놓아둔다.
9. 다시 같은 양의 DMSO를 가하여 최종 농도가 7%(V/V)이 되도록 하고, 얼음에 10~15분 둔다.
10. 미리 차게해 둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주한다.
11. 사용할 때까지 -70°C deep freezer에 보관한다. 상온에 나와 한번 녹았던 competent cell은 다시 보관할 경우 효율이 대단히 감소하므로 버려야 한다.
표 1. FSB 제조 (1 liter)
Reagent
Amount required/liter
Final concentration
1M Potassium acetate(pH7.5)
10 ml
10 mM
MnCl2-4H2O
8.91 g
45 mM
CaCl2-2H2O
1.47 g
10 mM
KCl
7.46 g
100 mM
Hexamminecobalt chloride
0.80 g
3 mM
Glycerol
100 ml
10 %
1 M potassium acetate는 90 ml의 순수한 물에 9.82 g의 potassium acetate를 녹인 후, 2 M acetic acid로 pH를 7.5로 맞춘 다음 물을 가하여 최종 부피가 100 ml 되도록 만든다. 만든 용액은 10 ml씩 나누어 -20°C에 보관한다.
* 위의 성분들을 모두 섞어 800 ml의 증류수에 녹인 다음, 0.1 N HCl을 이용하여 pH를 6.4로 맞춘다. 만약 pH가 6.4보다 낮아졌다면 염기를 가하여 다시 맞추지 말고 용액을 버린 다음 다시 처음부터 시작하여야 한다. 마지막으로 증류수로 최종 부피를 1 liter로 만든 다음 0.45-micron pore size filter로 여과하여 멸균된 용기에 담아 4°C에 보관한다.
2) Calcium chloride를 이용한 competent cell의 제조
이 방법은 Cohen등에 의해 개발된 방법을 약간 변형시킨 것으로, 효율은 Hanahan 방법에 비해 떨어지나 간편하고 보통 cloning목적으로 사용하기에는 충분하므로 실험실에서 많이 사용되는 방법이다. 이 방법으로 만든 competent cell은 시간이 오래 지날수록 형질전환 효율이 다소 감소하긴 하지만 -70°C deep freezer에 보관하여 사용할 수 있다.
실험방법
1. LB plate에 자란 DH5α colony를 LB 배지 2 ml에 접종한 후 밤새 키운다.
2. 위에서 키운 배양액 1 ml을 100 ml LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.600 이 0.4가 될 때까지 37°C shaking incubator에서 키운다.
3. 배양액을 50 ml conical tube에 넣고 얼음에 10분간 놓아둔다.
4. 4°C에서 4,500 rpm으로 10분간 원심분리한다.
5. 상층액을 완전히 제거한 후 미리 차게 해 둔 0.1 M filtered CaCl2 용액을 원래의 1/2부피로 넣고 부유시킨다.
6. 얼음에 15분 놓아두었다가 다시 4°C에서 3,000～4,000 rpm으로 10분간 원심분리한다.
7. 상층액을 버리고 처음의 1/10 부피의 filtered CaCl2 용액으로 부유시킨다.
8. 얼음에 30분 놓아두었다가 미리 차게 해둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주하고, 사용할 때까지 deep freezer에 보관한다.
3) Ultra-competent cell의 제조(Inoue method)
최근에 Inoue에 의해 소개된 방법이다(Gene 96: 23-28, 1990). 낮은 온도에서 배양한 균을 쓰는 것이 특징으로, 대단히 높은 효율의 competent cell을 얻을 수 있다.
실험방법
1. Agar plate(LB 또는 SOB)에 자란 E.coli DH5α colony를 LB 또는 SOB medium(10 mM MgCl2와 10 mM MgSO4 함유) 3 ml에 접종한 후 밤새 키운다.
2. 위에서 자란 균 1~2 ml을 250 ml의 SOB medium에 다시 접종한 후 18°C~상온에서 O.D.600이 0.6이 될 때까지 shaking incubator에서 키운다.
* 18°C에서 배양하는 것이 힘들 때가 많기 때문에 상온에서 배양을 하게 되지만, 낮은 온도에서 배양하는 것이 높은 효율의 세포를 얻게 되는 주요 과정이다. 균 농도 보다는 배양 온도에 신경을 쓸 것. 전날 colony 한 개를 접종한 후 overnight으로 배양하면 아침에 대략 이 정도의 균 농도가 된다.
3. 배양액을 멸균된 50 ml conical tube에 나누어 넣고 얼음에 10분 방치한다.
4. 4,500 rpm, 4°C에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집은 상태로 약 1분간 놓아둔다.
5. 미리 차게 해 둔 80 ml의 transformation buffer(TB)로 부드럽게 부유시킨 후 얼음에 10분 놓아둔다. TB의 성분은 10 mM PIPES, 55 mM MnCl2, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl이며, pH 6.7로 맞춘 용액이다.
6. 위와 같이 다시 원심분리한 후 20 ml의 TB에 부유시키고 DMSO를 7%(V/V)만큼 가한다. 이때 DMSO는 세포 부유액을 섞으면서 중앙에 천천히 떨어뜨린다. 다 넣은 후에도 5～10초간 부드럽게 섞도록 한다.
7. 얼음에 10분 놓아둔다.
8. 미리 차게해 둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주한다.
9. 사용할 때까지 -70°C deep freezer에 보관한다.
C. 박테리아의 형질전환
박테리아의 형질전환이란 plasmid DNA를 세포 내로 넣어주는 작업을 말한다. 형질전환은 거의 모든 cloning과정에 필수적이므로 가능한 한 효율적인 방법을 찾는 것이 중요하다. Large DNA는 small DNA보다 형질전환 효율이 떨어지며 DNA의 양이 너무 많아도 좋지 않으므로, 같은 competent cell을 사용하더라도 적당한 길이와 적당한 양의 DNA를 사용하는 것이 중요한 요소이다.
실험방법
1. -70°C deep freezer에 200 μl 씩 보관된 competent cell tube 하나를 꺼내어 손바닥에 쥐고 있으면 cell 용액이 녹기 시작한다. Cell 용액이 다 녹으면 곧바로 얼음에 넣어둔다.
2. DNA를 competent cell에 넣고 tube를 4~5번 기울이거나 가볍게 손끝으로 쳐서 부드럽게 섞는다.
* DNA 용액은 competent cell 부피의 5%를 넘지 않는 것이 좋다. 대개 competent cell은 200 μl를 사용하므로 DNA는 10 μl 이하로 조정한다. DNA의 양이 많다고 효율이 점점 증가하지는 않는다.
3. 얼음에 30분 동안 둔다.
4. 42°C 에서 90초간 heat shock을 준다.
5. 얼음에 2～3분 두었다가 LB 또는 SOC 배지 (SOB 배지에 20 mM glucose 함유) 800 μl를 넣고 잘 섞은 후, 37°C 에서 45분간 배양한다. Rock table을 사용하여 흔들어 주는 것도 좋다.
6. 미리 37°C에 두었던 LB (with ampicillin) plate에 위 혼합액을 적당량 pipette으로 떨어뜨린 후, 밀대로 골고루 펴준다.
* LacZ 유전자를 이용한 color selection을 하는 경우, 배지에 isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG)와 X-gal을 첨가해주어야 한다. X-gal(50 mg/ml) 20~40 μl와 IPTG(839 mM) 5~10 μl를 미세원침관에서 섞어 배지위에 떨어뜨리고 밀대로 골고루 펴주면 되는데, 37°C에 적어도 10분 두었다가 박테리아를 도말하도록 한다. X-gal은 50 mg/ml의 농도로 dimethylformamide(DMF)에 녹여 빛이 차단된 용기에 담아 -20°C에 보관하고, IPTG는 2 g을 증류수에 녹여 10 ml 까지 채운다음 0.22 μm-filter하여 1 ml씩 나누어 -20°C에 보관한다.
* 위에서 만들어진 혼합액은 대략 1 ml 정도가 된다. 이 혼합액을 모두 plate에 떨어 뜨리고 밀면 잘 밀리지도 않고 물이 흘러 배양도 잘 되지 않는다. 그러므로 이 혼합액에서 적당량의 액체를 제거하는 방법으로 다음과 같은 방법을 쓴다.
1) 과정 5까지 끝낸 균 용액을 10,000 rpm에서 15초간 원심 분리한다.
2) 상층액을 약 850 μl 정도 버린다.
3) 나머지 150 μl로 침전물을 부유시키고, 이를 plate에 도말한다.
* 대부분의 경우 vector와 insert를 ligation한 DNA로 형질전환할 경우, 위와 같이 하면 colony들이 잘 분리되는 정도로 배양된다. 그러나 self ligation의 경우에는 colony가 너무 많이 생겨 colony들끼리 잘 분리되지 않는다. Double stranded circular DNA를 쓰는 경우에는 더욱 그러하므로, 위 과정을 경험적으로 조금씩 바꾸어 실험해야 할 것이다. 자신이 없는 경우는 균 혼합액을 10 μl, 100 μl, 나머지 용액 이렇게 나누어 도말해 보면 된다.
7. 37°C 배양기에서 plate를 뒤집어서 밤새 배양한다. 12～16시간이면 colony를 관찰할 수 있다.
세균을 액체배지에 배양할 때 성장곡선을 측정하기 위하여 평판배지에서 콜로니숫자를 측정하는 콜로니계수법으로 세균의 숫자를 측정한다. 대량 배양할 때나 실험하는 샘플의 숫자가 많은 경우에는 배양액의 흡광도를 측정함으로써 세균의 생장을 측정할 수 있다. 이번 실험에서는 배양액에서 세균의 생장곡선을 흡광도 측정방법으로 조사한다.
2. 실험 원리
이 방법은 세균의 배양액에 일정한 파장의 빛을 통과시켰을 때 용액은 그 빛을 흡수 또는 산란시킬 수 있고 이 때 흡수된 빛의 양은 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 것이다. <그림1>은 흡광도계에서의 빛의 경로를 표시한 것이다. 전구에서 나온 백색광은 회절격자(Diffraction grating)에 의해서 일정한 파장 순서의 스펙트럼으로 배열되므로 파장조절장치를 이용하여 우리가 원하는 단일파장의 빛을 시료에 투사시킬 수 있다. 시료를 투사한 빛은 광전관(Phototube)을 거쳐서 검류계(Galvanometer)에 백분율로 표시할 수 있게 된다. 이때 투과된 빛의 양은 시료의 균체수에 반비례하게 된다. 따라서 여러 가지 비율로 희석된 배양액의 흡광도(Optical Density, OD)를 잰 다음 각 흡광도에서의 정확한 세표수를 알아내어 이들의 상관관계를 구해놓으면 흡광도 측정만으로도 미지의 균체수를 알아낼 수 있다.
3. 실험 재료 및 방법
▣ 재 료
․균주 : Escherichia coli 배양액(6시간 이상 배양)
․배지 : LB broth 배지, LB agar 배지(LB broth 배지에 Agar 15g/ℓ첨가)
․기구 및 시약 :분광 광도계,
무균대, 멸균된 피펫, 멸균된 희석용 시험관, 멸균된 증류수
▣ 과 정
(1) 멸균된 상태의 배지 100㎖에 E. coli 배양액 1㎖을 접종하여 키운다. (37℃, 200 rpm)
(2) 접종 후 4시간동안 0 time을 포함하여 매 30분마다 시료를 무균조작 방법으로 채취하여 다음과 같이 흡광도 측정을 수행한다. 시간별로 시료를 채취하여 흡광도(파장은 595nm 또는 600nm)를 잰다. 0 time에서의 OD600은 0.08～0.1로 출발하는 것이 적당하다. 배양시간에 따른 흡광도의 변화를 그래프용지를 사용하여 그려보고 이로부터 대수기에서의 Generation time을 간접적으로 구해본다. Generation time은 흠광도의 변화가 2배로 될 때까지 걸리는 시간이다.
4. 실험수행상 주의 할 점
(1) 시간별로 시료를 채취할 때 무균조작 하도록 하고 채취가 끝난 배지는 바로 배양 기에 넣어 시간을 지체하지 않도록 한다.
(2) 분광광도계(Spectrophotometer)를 사용할 때는 충분히 예열을 해야 하며 반드시 멸균된 동일 배지로 0점 조정을 한 후 사용한다.
5. 고찰
(1) 배양시간에 따라 세균의 변화를 반대수(Semi-log) 그래프 용지에 그려보고 Generation time(GT)을 직접 구해본다.
GT = t log2/ (logA-logB)
여기서 B = 대수생장기에서 한 시점에서의 세균수
A = 대수생장기에서 두번째 시점에서의 세균수
t = A, B 두 지점사이의 시간
(2) 흡광도 측정 및 콜로니 계수법의 두 가지 방법으로 구한 Generation time을 비교해보고, 또 대수기에서의 흡광도와 균체수의 상관관계를 알아보자. (E. coli에서는 OD600 = 1일때 약 0.8 x 109 cells/ml을 나타낸다.)
일정한 체적의 물질 내에 세균이 얼마나 오염되어 있는가를 알아보는 방법에는 여러 가지가 있다. 예컨대 우유에 오염된 세균수를 알아보려면 일정량의 우유를 슬라이드에 도말하여 현미경으로 직접 세어보거나, 혈구 계산에 흔히 쓰이는 혈구계수기(hemacytometer)로써 세균수를 세어 전체 용적의 세균수를 계산하는 방법도 있다. 그러나 위와 같은 방법은 표본에 세균수가 비교적 적은 경우에 적용하는 방법들인 것이다. 본 실험에서는 폐수, 우유, 식료품 등 어떠한 물질이든 간에 세균수 측정에 흔히 사용하는 두가지 방법에 대하여 자세히 알아 보기로 하자.
2. 실험재료 및 방법
1) 정량 평판법(Quantitative plating Method, Standard Plate Count)
표준 평판법(S.C.P)라고도 하며 그림 1 처럼 일정량의 멸균수를 주입한 희석병에 표본을 일정한 비율로 희석하여 한천배지의 평판에 접종하는 방법이다.
그림 1과 같이 샘플에서 1㎖을 취하여 멸균수 99㎖이 든 희석병 A에 접종하면 표본 원액은 100배로 희석된 셈이다. A 희석병에 1㎖을 정확히 따서 B의 99 ml에 접종하면 10,000배로 희석되며, 그와 같은 방법을 희석병 C에 적용하면 1,000,000배 희석된 셈이다. 그런데 표본 원액에 세균이 얼마나 존재하는지를 알지 못하므로 희석병 B와 C로부터 각각 0.1㎖와 1.0㎖씩 희석된 표본액을 따서 한천배지의 평판에 접종시키게 된다. 왜냐하면 희석병에서는 균체수가 지나치게 희석되므로 인하여 한천평판위에 콜로니를 형성치 못할 경우가 있을 것이며 또 어떤 경우는 희석병 B의 경우에도 균체수가 아직도 너무 많이 존재할 경우도 있을 것이므로 적어도 B와 C의 희석병에서 희석수를 따서 접종함으로써 실험결과를 상호 보완할 수 있을 것이다.
▣ 재 료
E.coli의 액체배양체,
nutrient agar,
멸균된 페트리 접시 다수, 멸균된 피펫 다수,
99㎖의 멸균수를 담은 마개달린 희석병(dilution blank)3개
▣ 과 정
① nutrient agar를 액화하여 50℃ 정도로 식히고 항온수조에 넣고 99㎖의 멸균수가 긴
세균배양에 필요한 배지는 배양하고자하는 미생물의 종류에 따라 적합한 것을 선택하여 사용하여야 한다. 따라서 미생물의 종류에 따라 배지의 제법이 다소 달라질 수 있다. 여기서는 배지를 준비할 때 기본적인 주의점과 멸균법 및 평판배지, 사면배지 준비법을 살펴보고, 세균배양에 가장 많이 쓰이는 영양배지의 제법을 실습하도록 한다.
1) 배양배지의 준비
배지를 만들 때는 그 조성에 따라 필요한 내용물을 저울 등으로 담아 용기에 담고 혼합하여 물을 가한 후 멸균하는데, 세균배양에 필요한 다양한 배지들이 조성대로 이미 만들어져 탈수시킨 상태(dehydracted media)로 시판되는 종류도 많다. 탈수배지는 정해진 농도로 물을 가한 후, 멸균하여 사용하면 된다. 일반적으로 배지를 만들 때는 다음 사항을 지켜야 한다.
① 배지를 담을 유리용기는 가능하면 깨끗한 것으로 경질유리제품 (pyrex)을 이용한다. ② 특별히 언급한 경우가 아니면 증류수를 사용한다.
③ 배지 내용물을 정확히 달아 언급한 순서대로 첨가한다.
배지의 pH는 미생물의 생장 에 의해 변화된다. 따라서 필요할 경우 배지 준비시 pH측정기나 pH 지시종이로 재고 지정한대로 배지의 pH를 맟추도록 한다. 대개의 배지는 그 구성성분이 완충능을 갖도록 되어있으나, 필요한 경우 제조시 산이나 알칼리를 첨가하여 pH를 보정해 주어야 한다.
④ 물에 녹인 배지는 특별히 불용성 물질이 함유된 경우를 제외하고는 맑아야하며, 배지 가 맑아야만 접종 후 균체의 생장여부를 쉽게 판독할 수 있다. 따라서, 배지를 맑게 하기 위해서는 여과지 등으로 직접 여과시키거나, 계란의 흰자(egg white)를 가한 후 가열하면 녹지 않은 입자들이 계란 흰자와 함께 응어리로 뭉쳐지는데, 이를 여과하여 맑게 만들기도 한다. 여과시 배지의 양이 적은 것은 여과지로 (Whatman No. 1) 거르 고, 양이 많을 경우에는 두꺼운 펼프층이나, 목화솜 등을 Buchner funnel에 진공펌프 를 이용하여 여과시키도록 한다. 이런 연후에 구멍크기가 작은 여과지로 걸러 모든 현탁입자를 제거시킨다.
⑤ 배양배지는 멸균 전에 사용하기 편리한 양만큼 솜마개, 금속마개 또는 나선형 뚜껑이 덮힌 시험관이나 플라스크에 나누어 담는다.
2) 배지 멸균시의 일반적인 유의사항
배지는 일반적으로 고압증기멸균기(autoclave)를 사용하여 121℃(101.3kpa 또는 15 p.s.i)에서 15분정도 멸균하나 멸균시간은 용기의 종류나 배지의 양에 따라 다르다. 멸균시간은 정확히 측정하여 결정하도록 한다. 왜냐하면 너무 가열되면 대부분의 배지성분이 손상되기 때문이다. 또한 배지 멸균시 솜마게는 종이나 알루미늄 박으로 싸서 너무 젖지 않도록 하고, 나선형 뚜껑등은 약간 느슨하게 닫아서 가열에 의한 팽창 때문에 깨지지 않도록 하고, 멸균후에 꺼내어 꽉 잠그도록 한다.
열에 약한 배지 (또는 배지 성분)는 여과하거나 변형된 열처리법으로 멸균하되 초기에 배지를 만들 때 오염되지 않도록 무균조작에 신경쓰도록 한다. 주로 열에 약한 성분은 여과하고, 열에 안정한 성분은 별도로 습윤멸균한 후 무균적으로 둘을 섞어 사용한다.
3) 탄수화물의 멸균과정
일반적으로 가능하면 고농도의 용액을 여과하여 사용한다. 탄수화물의 종류에 따라 다음의 방법으로도 멸균가능하다.
① Tydalization : 하루간격으로 3일동안 100℃에서 30분간 끓인다. 주로 adonitol, arabinose, inositol, raffinose, rhamnose, sorbitol, trehalose.
② 35kpa(약 5.2 p.s.i)에서 25분간 습윤멸균 : aesculin, fructose, glucose, glycerol, lactose, mannitol, salicin, sucrose 등
③ 여과법으로만 사용할 것 : inulin, maltose, xylose.
열에 안정한 배지성분은 모두 물에 녹여 따로 습윤멸균한 후, 위와 같이 따로 멸균한 탄수화물을 무균적으로 첨가한다. 이 경우 곧바로 사용하지 말고 37℃에서 하루밤 방치하여 멸균여부를 확인한후 사용하도록 하고, 특정당의 이용하는데 사용하고자 할 때는 그 배지에서 확실히 생장하는 것으로 알려진 표준 균주를 배양했을 대 양성반응이 나타나는지 확인한 후에 사용하도록 함이 현명하다.
④ 보관법 : 나선뚜껑 시험관에 든 배지는 직사광선을 피하여 상온에서 보관한다. 이 용기는 배지의 증발을 방지하여 보관시 배지의 건조를 방지하는 이점이 있다. 솜마개 또는 금속마개를 한 시험관이나 플라스크는 4℃에 보관하도록 한다.
4) 고체 평판 및 사면배지의 준비법
고체배지는 다량준비하여 멸균하고 (미리 멸균하여 둔 것은 사용직전에 고압증기 처리하거나 끓여서 녹이고) 50℃로 식힌 후, 열에 약한 혈액, 항생제, 당, 아미노산등은 역시 45℃정도로 맞추어 첨가하되 거품이 일지 않도록 용기를 조심스럽게 흔들어 혼합한다. 그런 다음 멸균된 페트리 접시나 용기에 나누어 붓는다.
① 페트리접시에 붓는 법 : 멸균된 페트리 접시를 바닥이 평평한 곳에 준비해 두고 45～50℃로 식힌 배지가 든 플라스크의 입구를 불꽃으로 살균한 다음, 페트리접시의 뚜껑을 열고 15㎖ 정도씩 붓는다. 이때 오염이 되지 않도록 주의하고 배지를 부은 페트리접시는 배지가 굳을 때까지 움직이지 않도록 한다. 굳은 고체 평판배지는 비닐막 등으로 잘 싸서 4℃에 보관하도록 하며, 사용 전에 잘 말려서 사용하도록 한다. 한천배지의 표면에 물기가 있으면 콜로니가 명확히 구분되지 않게 되어 단일 콜로니의 선별이 어렵다. 4℃에서 며칠간 보관한 경우는 건조시간이 단축되거나, 따로 건조시킬 필요가 없는데, 필요할 경우 37℃에서 하룻밤 방치하여 배지를 말리도록 한다. 이 과정은 건조와 동시에 배지의 오염여부를 확인할 수 있는 장점이 있다.
② 사면배지 준비법 : 물에 녹인 배지를 중탕하여 잘 녹인 후 약 5㎖씩 (시험관의 크기에 따라 양을 조절한다) 나누어 담고 마개한 후, 습윤멸균한다. 멸균이 끝난 후 배지를 비스듬히 기울여(30-40도 정도) 굳힌다. 이 때 사면배지가 너무 경사지거나 배지량이 많아서 시험관 입구 가까이에 도달하지 않도록 주의한다. 대개 시험관의 ½정도로 한다. 필요에 따라 접종침을 찔러 접종할 경우에는 약 7㎖의 배지를 붓고 바로 세워서 굳히도록 한다. 사면배지 역시 4℃에서 보관하도록 한다.
2. 실험 재료 및 방법
▣ 재 료
한천(agar), 효모추출물(yeast extract), tryptone, NaCl,
2ℓ짜리 삼각플라스크 혹은 비이커,
500㎖짜리 삼각플라스크, 500㎖짜리 눈금 실린더,
솜, 마개,
pH측정기, 저울, 1N HCl, 1N NaOH, 멸균기
시약용 숟갈, 유산지, 증류수가 들어 있는 비이커 (또는 세척병)
▣ 과 정
① 2ℓ플라스크에 증류수 500㎖을 붓는다.
② tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g 을 플라스크에 달아 넣는다. 이때 유산지 를 천칭위에 올려놓고, 증류수로 잘 씻은 시약용 숟갈을 휴지로 닦아 물기를 완전히 제거하여, 시약을 달도록 한다. 한 시약을 달고 난 후 에는 숟갈을 꼭 세척하도록 하 며, 부주의하여 시약통의 시약이 다른 시약에 의해 오염되지 않도록 주의한다. 또한 천칭에 시약을 흘리지 않도록 주의하며, 흘린 경우에는 즉시 닦아내도록 한다.
③ 플라스크를 잘 흔들어 내용물을 다 녹인다. 증류수를 가하여 전체량이 1ℓ가 되도록 한다.
④ 위 용액을 500㎖ 플라스크에 250㎖씩 나누어 담고 다음과 같이 한다. 첫 번째 배지에는 더 이상 배지성분을 첨가하지 않고 액체배지로 사용하고, 두 번째 배지에는 한천 3.75g (고체배지를 만들 때는 한천을 배지 1 리터당 15g을 첨가)을 가하고 흔들 어준 다음, 5분쯤후에 중탕하여 녹이되, 가끔 흔들어 준다. 이렇게 만든 것이 영양한 천배지이다.
⑤ 위의 네 가지 배지를 pH측정기(또는 pH 측정용종이)로 1N HCl이나 1N NaOH를 가 하여 pH 7.0 으로 맞춘다. 사용 후 pH 전극(electrode)은 잘 세척한다.
⑥ 시험관에 각각 나누어 담고 마개를 한 후 습윤멸균을 121℃(15 p.s.i)에서 15～20분 멸균한다.
⑦ 멸균이 끝나면 사면배지 만들어 놓은 것은 기울여 눕혀 사면배지를 만들고, 식혀서 4℃에 보관한다.
3. 실험수행상 주의 할 점
영양배지 등 영양소가 풍부한 배지에 포도당을 첨가할 때는 일반적으로 다른 배지성분과 함께 녹여 습윤멸균 하기도하며, 멸균시간을 10분 내외로 단축하기도 한다. 그러나 생장율 측정또는 생리적 특성 조사용 배지를 만들 때는 앞서 살펴본 바와 같이 여과하여 멸균한 높은 농도의 포도당 저장용액을 만들어두고 50℃정도로 식힌 배지에 첨가하도록 한다.
[éinʃənt] 1. ancient 오랜 옛날에 있었던 또는 시작된. 2. antiquated 구식이라 쓸모없게 된 ◇ antiquated system 구식이 된 제도. 3. antique 오래되어 진기한 ◇ antique chair 옛날 의자. 4. old-fashioned 시대에 뒤진, 구태의연한, 유행에 뒤진
-Zanjani'ssheepisthelatestcontributiontothecontroversialfieldofinterspeciescloning./Ininterspecific hybridisations, however, theinheritanceof plastids appears to bemoreerratic.
im·plantvt. [의학] [장기·피부 등을] 이식하다; [인공 장기 등을] 끼워넣다.
vi. [생물] [배(胚)·수정란이] (자궁에) 착상하다.
pay a visit to ..[사람·물건을] 찾아가다, 들르다(※뚜렷한 목적으로 잠깐 방문시) seem […에게] (…처럼) 보이다, 생각되다, (…)인 듯하다[to ‥]