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Plasmid DNA의 분리 및 정제방법

플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 totall cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chromosomal DNA 로부터 분리하여야 한다. 플라스미드 분리방법은 플라스미드 DNA와 bacterial DNA의 물리적인 차이점에 의해 분리된다. 가장 큰 플라스미드의 길이는 E. coli 의 염색체 길이에 8%밖에 되지 않으며 대부분이 작다.

플라스미드와 bacteria DNA의 구조에 차이로부터 분리하는 방법이 있다. 플라스미드와 염색체는 구형인데 염색체는 extract 시 구형에서 선형조각으로 깨어지며 플라스미드에는 구형으로써 변화가 없다. 이 구조적인 차이점을 이용하여 정제된 플라스미드를 얻을 수 있다.

<분리방법> :Minipreps of plasmid DNA

bacterial cells로부터 plasmid DNA를 소량으로 분리하는 방법은 대단히 많지만

성공률과 속도를 생각하여 세 가지 방법으로 소개하면

Alkaline lysis prep, boiling method 그리고 lithium-based procedure 이다.

① Alkaline lysis miniprep

alkaline lysis procedure(Bimboim, Doly, 1979)은 가장 일반적으로 쓰이는 분리방법이다. Plasmid DNA는 plasmid을 지니고 있는 bacteria에서 적은 양의 배양으로 분리될수 있다. Bacteria는 sodium dodecyle sulfate(SDS), NaOH를 함유하는 용액으로 처리하여 용균되어 진다(여기서 SDS는 bacterial proteins을 변성시키며 NaOH는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 변성시킨다). 다음 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중성화시키는데 이것은 covalently closed plasmid DNA를 빠르게 reanneal 시킨다. chromosomal DNA와 bacterial proteins의 대부분은 침전되며(SDS는 potassium과 화합물을 이룬다) 침전물은 원심분리로서 제거할 수 있다. plasmid DNA는 상등액에 남아있게 되고 ethanol precipitation으로 집중시킬 수가 있다.

A. Materials

1.Soln.1 (lysis soln)-autoclave

100ml preparation

50mM Glucose 0.9g

10mM EDTA(pH 8.0) 2ml 0.5M EDTA

25mM Tris.cl(pH 8.0) 25ml 0.1M Tris.cl

D.W Up to 100ml

2.Soln.2 (NaOH/SDS soln)-autoclave, Fersh soln only

20ml preparation

0.2N NaOH 0.16g NaOH

1w/v% SDS 0.2 g SDS

D.W Up to 20ml

Store at r.t,if white granules detected MUST discard!

cf) Quick preparation

Autoclaved 2g/50ml (1N) NaOH 4ml -+

Autoclaved 10w/v% SDS 2ml -+ 40℃에서 녹여서 사용

Autoclaved D.W 16ml -+

3.soln.3 -M(KOAc 3M,pH 4.8)-autoclave

100ml preparation

5M KOAc (94.15g/200ml D.W) 60ml

Glacial HOAc 11.5ml

D.W 28.5ml

4. RNase solution

20mg pancreatic RNase/ml in 10mM Tris HCl(pH 7.5), 15mM NaCl

Heat at 100'C for 15min, and store at -20℃

5. TE buffer

10mM Tris HCl(pH 8.0)

1mM EDTA(pH 8.0)

B. Procedure

1 .Grow cell culture in L broth + Ampicillin(100ug/ml final conc.)overnight.

2. Take 1.0ml cell suspention into 1.5msl Eppendorf tube.Centrifuge 15 seconds in 10,000×g

3. Remove supernatant carefully with fine aspirator

4. Lysis soln. preparation ; 4mg lysozyme/ml soln.1

5. Add 100ul Lysis soln. to suspend the pellet and hold at r.t 5min.

cf) 만일 cell culture 가 없고 plate에 긁어 놓은 것이 있으면 이쑤시게를 이용 좁쌀크기로 떠내서 바로 soln.1을 넣은 tube에 넣고 가볍게 vortexing을 실시하여 suspention시킨 것을 이용한다.

6. Add 200ul NaOH/SDS reagent(soln.2) mix and hold on ice bed 5min.

soln.2가 들어가면 투명하게 되며 점도가 높은 것이 ice-bed에 두면 점성이 낮아진다.

7. Add 150ul of KOAc(pH4.8,Soln.3-M),flicking,and store the tube on ice bed 5min.

soln.3가 들어가면 하얗게 되며 ice bed에 두면 점도가 낮아지고

liquid phase와 protein/gDNA phase가 구분되어진다.

8. Add 400ul of PCI(25:24:1),mix and centrifuge 5min.at 15℃

9. Transfer the supernatent to a fresh tube,

Add 500ul 100% EtOH,vortex 10sec, and stay for 5min. at r.t.

10. Centrifuge 5min.at 15oC and discard the supernatent

11. Drain off the EtOH completely and vacuum pump drying 15min.

12. Resuspention the pellet with 20ug/ml RNase contained 43ul D.W or TE buffer.

② Boiling miniprep

Plasmid를 지닌 bacteria는 lysozyme, Triton(a nonionic detergent), 열처리 등으로 깨어질수 있다. chromosomal DNA는 세포막에 결합된 상태로 남아있게 되고 원심분리로서 침전시켜 모을 수 있으며 plasmid DNA는 상등액에서 isopropanol(Holmes and Quigley,1981)로 침전시켜 분리할 수 있다. boiling miniprep는 적은 양의 plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만 분리된 plasmid DNA는 alkaline lysis miniprep 보다 quality가 떨어진다.

A. Material

LB medium(적합한 항생제가 첨가된 배지)

STET soln.

Hen egg white lysozyme

Isopropanol, ice-cold

TE buffer

10 mg/ml DNase-free RNase

1.5-ml microcentrifuge tubes

Boiling water bath(100℃)

B. Procedure

1. 단일콜로니를 5ml 멸균된 LB medium에서 overnight 한다

(37℃에서 최소한 mid-log phase 까지 배양한다).

2. 1.5ml의 종배양액을 1.5ml microcentrifuge tube에 옮기고 원심분리하여 cells을 모은다 (pellet). 상등액을 제거한다.

3. 200㎍ lysozyme이 든 STET soln. 300㎕에 pellet을 녹인다.

4. 30s∼10min정도 얼음물에다 tube를 정치한다.

5. boiling water bath(100℃)에 1∼2 min 정도 tube를 정치한다.

6. 15∼30min정도 원심분리한다.

7. pipet으로 상등액을 새로운 tube에 옮긴다(이때 pellet에 주의하여 옮긴다).

200㎕(상등 액과 같은 양) cold isopropanol에 섞는다.

-20℃에서 15∼30 min 정도 정치한다. 다시 5 min 정도 원심분리한다.

8. 상등액을 제거하고 pellet이 마를 때 까지 진공상태로 정치한다.

9. 50㎕ TE buffer에 pellet을 녹여 보관한다.

③ Lithium miniprep

Plasmid DNA는 평판 또는 액체배지에서 배양되는 E.coli로부터 획득할 수 있는데, Bacterial cells은 Triton X-100/LiCl과 phenol/chloroform을 처리하여야만 한다. 이것은 plasmid DNA의 가용성화와 chromosomal DNA, cellular debris등에 침전을 일으킨다. debris는 원심분리를 통해 제거할 수 있다. 이러한 분리절차로 chromosomal DNA 등을 제외한 plasmid DNA만을 얻을 수 있다.

이번 분리방법은 가장 빠르게 plasmid DNA를 분리하는 방법이며 대부분의 생물학적 적용면에 이용할 수 있는 정제된 plasmid DNA를 분리할 수 있다.

A. Materials

TELT soln.

LB medium(항생제첨가배지)

1:1(w/v) phenol/chloroform

100% ethanol(-20℃보관)

TE buffer

10mg/ml DNase-free RNase A

1.5ml microcentrifuge tubes

B. Procedure

1. 형질전환체 colonies로부터 plasmid DNA를 분리하기 위해 다음과 같이 세포를 준비.

a. microspatula를 이용하여 LB agar plate에 있는 bacterial colony(2∼5mm diameter까지 배양된 colony)을 떼어 100㎕ TELT soln.이 들어있는 1.5-ml microcentrifuge tube에 옮긴다.

b. step 3의 과정을 위해 위의 혼합액을 Vortex하여둔다.

2. 액체배지로부터 plasmid DNA를 분리하기위하여 다음과 같이 세포를 준비하여둔다.

a. 적합한 항생제가 첨가된 1.8ml LB medium에 bacteria colony를 배양한다

(대략 30℃, 18∼24hr까지 진탕배양).

b. 신중히 배양액을 1.5-ml microcentrifuge tube에 옮긴다.

c. 세포를 원심분리(10,000×g, for 20sec)하여 pellet을 형성시킨다.

d. tube를 수직상태로 들고 상등액을 aspirator로 제거한다.

e. 100㎕ TELT soln.을 pellet에 넣고 vortex로 녹인다.

3. 100㎕ 1:1 phenol/chloroform을 첨가하고 5sec 정도 vortex를 한다.

4. 원심분리(15,000×g, for 1min)를 한다.

5. pipettor를 이용하여 신중히 75㎕ upper aqueous phase를 빼내어 새로운 microcentrifuge tube에 옮긴다.

6. 상등액에 150㎕ 100% ethanol(chilled)를 첨가, plasmid DNA가 침전될 수 있도록 섞는다.

7. 원심분리(for 5min)하여 pellet을 형성시킨다.

8. 상등액을 제거한다.

9. 1ml cold 100% ethanol로 씻어주고 step 6과 7을 반복하여 nucleic acid pellet을 회수 한다.

10. tube를 cap으로 닫고 cap에 작은 구멍을 낸다. vacuum dessicator에 tube 위치시켜 놓 는다. nucleic acid pellet이 완벽하게 마를때까지 진공상태를 유지한다.

11. 30㎕ TE buffer에 녹인다.

<정제방법>

1. CsCl/Ethidium Bromide Equilibrium Centrifugation에 의한 plasmid DNA 정제

이 방법은 대부분의 contaminants로부터 정제도가 높은 plasmid DNA 얻을 수 있다. 그러나 ethidium bromide의 사용과 밀도구배를 위해, 많은 시간이 걸리는 초원심분리가 필요하다.

A. Material

TE buffer

Cesium chloride

10mg/ml ethidium bromide

CsCl/TE Soln.

Dowex AG50W-X8 cation exchange resin

TE buffer/0.2M NaCl

100% and 70% ethanol

Beckman VTi65 or VTi80 rotor(or equivalent)

5ml quick-seal ultracentrifuge tube

3ml syringes with 20-G needles

B. Procedure

1. 4ml TE buffer 로 crude lysate prep.의 마지막 스텝에서 얻어진 pellet을 녹인다.

또한 4.4g CsCl 첨가하여 용해시키고 10mg/ml ethidium bromide의 0.4ml를 가한다.

<주의할점>

Ethidium bromide는 돌연변이원이며 환경에 매우 위험한 물질이므로 이용시 신중하게 해야하며 장갑을 끼고 실험을 하도록 한다.

ethidium bromide는 용액에 남아있는 단백질과 화합물을 이루어 진한 적생을 형성하여 침전된다. 이 침전물은 lysate-CsCl/ethidium bromide 용액을 실온, ∼2000×g로 원심분리 하여 제거할 수 있다.

이 절차 후에는 protein/ethidium bromide complex는 용액의 상위 부위에 하나의 disc를 형성한다. 용액을 pipett을 이용하여 disc 아래부위만을 뽑아낸다.

2. 5-ml ultracentrifuge tube에 용액을 옮긴다. 필요시 CsCl/TE 용액으로 채우고 밀봉한 다. 원심분리(3.5hr at 20℃, 500,000×g 또는 14hr at 350,000×g)에서 원심분리하여 plasmid band를 형성시킨다.

*이 step은 매우 중요한 부분으로 원심분리 시 온도가 15℃ 이하에서 시행하여야 한 다. 구배를 하기 위해서 고농도의 cesium chloride와 높은 원심력이 필요하기 때문이며 낮은 온도에서 시행m시 cesium chloride가 tube 바닥으로 침전이 된다.

3. 20-G needle을 tube의 상위부분에 조심스럽게 삽입하고 3-ml syringe과 다른 20-G needle결합시켜 plasmid band의 ∼ 1cm 아랫부위에 주입시켜 plasmid band를 흡입한다.

4. 만약 고도로 정제된 plasmid DNA를 얻기 위해서라면 두 번째 ultracentrifuge를 시행하 여 RNA와 chromosomal DNA를 제거한다.

5. 유리 또는 플라스틱 column에 plasmid DNA/ethidium bromide용액 부피의 1.5∼2배 정도 의 Dowex AG50W-X8 column을 채운다.

그것을 wash과 평형을 위해 TE buffer/0.2 M NaCl 를 column에 흘려보낸다.

6. resin을 건들지 않고 그 위에 직접적으로 plasmid DNA/ethidium bromide용액을 채운다.

7. loading 후 직접적으로 column으로부터 흘러 나오는 용액을 수집하기 시작한다. volume laded의 두배가 되는 TE buffer/0.2M NaCl을 column에 흘려보낸다.

plasmid DNA는 resin을 통해 흘러 나오고 ethidium bromide는 resin에 남아 있게 된다 (윗부분은 적색을 띤다).

8. 2vol의 100% ethanol(-20℃보관)를 plasmid DNA에 가하여 원심분리(10min 4℃, 10,000×g).

<주의 할점>

이 용액은 -20℃이하가 되면 안되는데 : cesium chloride가 침전되기 때문이다.

9. 70% ethanol로 wash 후 vacuum상태에서 건조시킨다. TE buffer로 pellet을 녹이고 4℃에 서 보관한다.

2. PEG Precipitation

이 방법은 매우 빠르고 편리하다. 또한 어는 step에서든 멈출수 있고 ultracentrifugation step과 ethidium bromide를 사용하지도 않는다.

A. Materials

Glucose/Tris/EDTA solution

10mg/ml DNase-free RNase

NaOH/SDS soln.

Potassium acetate soln.

Buffered phenol

24:1 chloroform/isoamyl alcohol

10M ammonium acetate

100% and 70% ethanol

TE buffer

PEG soln.

3 M sodium acetate, pH 5.5

Sorvall SS-34 or Beckman JA-17 rotor

Sorvall HB-4 rotor

B. Method

1. crude lysate prep.의 마지막 스텝에서 얻어진 pellet을 1ml glucose/Tris/EDTA soln.에 녹인다.

2. 최종농도가 20㎍/ml가 되도록 RNase을 첨가하여 20min, 37℃에서 정치한다.

3. NaOH/SDS soln.을 2ml 첨가한다.

tube를 상하로 뒤집어 섞고 실온에서 5∼10min 정도 정 치한다.

4. 1.5-ml potassium acetate soln.을 첨가하여 tube를 상하로 뒤집어 섞고

실온에서 5∼ 10min 정도 정치한다.

5. 실온에서 10분 동안 원심분리한다(20,000×g).

6. 상등액을 새로운 tube에 옮긴다. 흰색의 침전물은 SDS-potassium complex이다.

이것은 다른 chromosomal DNA를 포함하며 crude lysate가 남아 있다.

7. phenol과 chloroform/isoamyl alcohol로 extract한다.

8. 10M ammonium acetate의 1/4vol을 용액에 넣고 섞는다.

100% ethanol의 2vol을 tube에 넣고 드라이아스에 10min 동안 정치한다.

원심분리(10min, 4℃, 10,000×g)하여 plasmid DNA를 회수한다.

9. 70% ethanol로 pellet을 씻고 vacuum에서 건조시킨다.

2ml TE buffer을 첨가하여 녹이고

0.8ml PEG soln.을 첨가하여 0℃에서 1∼15hr 동안 정치한다.

10. 원심분리(20min, 4℃, 10,000×g)하여 plasmid DNA을 회수한다.

11. 1ml TE buffer에 plasmid DNA를 녹이고 ethanol prep.을 행한다.

12. TE buffer로 침전된 plasmid DNA를 녹인다.

<정리>

·plasmid DNA의 charge를 이용 - plasmid와 같은 DNA는 일반적으로 (-)charge를 띠므로 anion-exchange resin을 이용한 column을 사용해 분리.

·size를 이용한 분리 - centrifugation을 이용함 (1번)

conformation을 이용한 분리 - plasmid는 3가지 형태로 존재

(하나의 plasmid가 electrophoresis상에 3개의 band로 보 인다.)

linear > open circular > supercoiled

① alkaline denaturation을 이용

- pH변화에 따라서 non-supercoiled DNA가 denaturation되는 성질을 이용

그러나 supercoiled DNA는 안정함

ⓐ sodium hydroxide 첨가 (pH 12∼12.5) - non-supercoiled DNA의 H-bond 파괴하여 single stranded DNA형성

ⓑ sodium acetate 첨가 (pH 4.8) - 파괴된 ssDNA가 tangled mass형성

ⓒ centrifugation - tangled mass와 supercoiled DNA의 분리

② Ethidium bromide

- caesium chloride density gradient centrifugation

- plasmid DNA의 밀도(1.7 g/cm3)를 이용하여 분리

ⓐ protein이 가장 위층에, DNA가 중간 그리고 RNA가 가장 아래쪽에 위치

ⓑ EtBr의 도입 - double helix의 부분적인 unwinding을 유발 (>3.4Å),

linear DNA의 사이에 끼어들어 0.125 g/cm3만큼 밀도를 감소시킴

(linear and open circular DNA와 supercoiled DNA의 분리를 초래),

- DNA에 결합된 EtBr은 n-butanol로 제거

Plasmid Preparation

Introduction

Alkali lysis method 의 원리 / Solution I, Solution II, Solution III

Supercoiled(closed circular) DNA와 open circular DNA

DNA precipitation(ethanol) / Biophotometer

I. Goal

DNA preparation 과정을 구분하여 이해하고 원리를 설명할 수 있다.

II. Materials

Cell,

Solution I,

Solution II,

Solution III,

phenol:chloroform(1:1),

100% ethanol,

SDW, ice,

LA(LB+Ampicillin) plate,

III. Procedure

1. 항생제가 첨가된 plate에 자란 colony를 백금선 루프로 한 개 따서 동일한 항생제가

2. 3 μl가 첨가된 LA배지에 seeding하여 37°C incubator에서 12-16시간 배양한다.

3. 10시간 이상 배양한 cell 1.5ml를 eppendrof tube로 옮겨 14,000rpm에서30sec - 1min하거나 15ml culture tube 일경우3,000rpm에서 15-20min

4. 상층액을 버리고, cell pellet에 Solution I를 100 μl 넣고 vortexing 하여 완전히 녹인다.

5. Solution II를 200 μl첨가한 후, tube를 inverting 하여 조심스럽게(5-6회) 섞어준다.

6. Solution III를 150μl 첨가하여 inverting하여 섞어준다.

7. ice에 5min간 놓아둔다.

8. 4°C, 15,000rpm으로 5min centrifuge한 후 상층액을 new eppendrof tube에 옮기고 남아있는 protein을 제거하기 위해 phenol:chloroform(1:1)을 상층액과 동일한 부피로 섞어서 10-15sec vortexing 후 Max.rpm에centrufuge한다.

9. centrifuge한 tube의 상층액을 new tube에 옮긴 후 2-2.5volume의 100% ethanol를 첨가한 후 흔들어준다.

10. 4°C, Max.rpm에centrifuge 10-15min 하면 yellowish white pellet이 생성된다.

11. ethanol을 pellet에 영향을 주지 않고 제거한 후에 spin-down 시키고 상온에서 건조시킨다.

12. 생성된 pellet의 양에 따라 적량의 SDW로 녹인다.

13. miniprep 한DNA 1μl + SDW 49μl로 dilution 시킨 후에 DNA concentration를 Biophotometer로 측정한다.

IV. Results

chromosomal DNA와 plasmid DNA의 분리 과정을 설명할 수 있다.

E.coli 배양 및 관련 시약 준비

1.1. A. Plate의 제조

Plate는 박테리아가 자랄 수 있는 최적의 환경이어야 한다. 박테리아는 plate 상에서 자라 colony를 형성하는데, 한 개의 colony는 한 개의 clone으로부터 자란 것이므로 이를 분획하여 여러 실험에 사용할 수 있게 된다. Plate의 조성은 배양시 사용하는 액체 배지(media)의 조성에 agar를 첨가한 것이다. 이때 첨가하는 agar의 농도는 1.5%이며, top agar와 같은 특수한 용도로 사용하기 위해서는 agar의 농도를 변화시키기도 한다.

실험방법

1. Plate를 만들고자 하는 배지를 만든다. 각 배지의 조성은 다음과 같다.

1) LB 배지 (Luria-Bertani medium) 1 liter

1.1.1.1. bacto-tryptone 10 g

1.1.1.2. bacto-yeast extract 5 g

1.1.1.3. NaCl 10 g

1.1.1.4. * 실험실에서 가장 흔히 사용되는 배지이다. 위 성분 950 ml의 증류수에 녹인 후 pH를 7로 맞추기 위해 5 N NaOH를 첨가(약 200 μl)하고 증류수로 1 liter로 채운다음 autoclave한다.

2) TB 배지 (Terrific Broth) 1 liter

1.1.1.5. bacto-tryptone 12 g

1.1.1.6. bacto-yeast extract 24 g

1.1.1.7. glycerol 4 ml

1.1.1.8. * Glycerol이 첨가되어 균을 단시간에 대단히 높은 농도로 배양할 수 있는 배지이다. 900 ml의 증류수에 녹인 후 autoclave한다. 사용하기 직전에 phosphate buffer(0.17 M KH2PO4, 0.72 M K2HPO4)를 100 ml 첨가한 후 사용한다. Phosphate buffer는 90 ml 증류수에 2.31 g의 KH2PO4와 12.54 g의 K2HPO4을 잘 녹인 후 증류수로 100 ml 까지 채우고 멸균하여 사용한다.

3) SOB 배지1 liter

1.1.1.9. bacto-tryptone 20 g

1.1.1.10. bacto-yeast extract 5 g

1.1.1.11. NaCl 0.5 g

1.1.1.12. * Competent cell 제조시에 사용하는 배지이다. 950 ml의 증류수에 녹인 후 250 mM KCl 10 ml를 첨가하고 5 N NaOH를 이용하여 pH를 7로 맞춘 다음 증류수로 1 liter까지 채우고 autoclave한다. 사용하기 직전에 멸균한 2 M MgCl2를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하여 사용한다.

4) SOC 배지 (Terrific Broth)

* 20 mM의 MgCl2가 함유된 SOB 배지에 20 mM glucose가 첨가된 배지이다. 1 M glucose 용액은 100 ml에 18 g의 glucose를 녹여 0.22 μm-pore의 filter를 통과시켜 사용한다. 박테리아의 형질전환시에 사용한다.

5) M9 Minimal 배지 1 liter

1.1.1.13. Na2HPO4-7H2O 6 g

1.1.1.14. KH2PO4 3 g

1.1.1.15. NaCl 0.5 g

1.1.1.16. NH4Cl 1 g

1.1.1.17. * M13 phage의 cloning 시에 사용할 수 있다. M9 plate를 제조하는경우는 agar 첨가 후 멸균한 배지가 적당히 식었을 때 다음과 같은 것들을 넣어준 다음 plate를 만들어야 한다.

1.1.1.18. 20% glucose (filtered) 10 ml

1.1.1.19. 0.1 M CaCl2 (autoclaved) 1 ml

1.1.1.20. 1 M MgSO4 (autoclaved) 1 ml

1.1.1.21. 100 mg/ml Thiamine (filtered) 50 ml

6) Brain infusion 배지 (Penassay 배지) 1 liter

1.1.1.22. 0.15% beef extract

1.1.1.23. 0.15% yeast extract

1.1.1.24. 0.5% peptone

1.1.1.25. 0.1% glucose

1.1.1.26. 0.35% NaCl

1.1.1.27. 0.37% K2HPO4

1.1.1.28. 0.13% KH2PO4

* 시약상에서 혼합된 가루를 판매하므로 1 liter를 제조하기 위해 37 g을 혼합하여 사용한다.

2. 위의 배지는 액체로 사용하기도 하는데, 이를 이용한 plate를 만드는 경우 autoclave를 하기 전에최종농도 1.5%가 되도록 agar powder(15 g/liter)를 첨가한다.

3. 15 lb/sq로 20분 이상 autoclave한다.

4. 배지가 적당히(65°C 정도) 식을 때까지 기다린 후 필요하면 ampicillin을 60 μg/ml가 되도록 첨가하고 잘 흔들어 섞는다.

* Ampicillin은 가루를 증류수에 녹여 50~100 mg/ml의 농도로 만들고 filter 후 1 ml 씩 분주하여 -20°C에 보관한다.

5. 배지를 petridish에 조심스럽게 붓고 기포가 생기면 달구어진 loop를 이용하여 제거한다. 하루정도 상온에 놓아둔 후 wrap으로 잘 싸서 4°C에 뒤집어서 보관한다.

* 배지의 온도가 너무 높으면 ampicillin의 활성이 떨어지고, 배지가 너무 식으면 plate를 제조하는 도중 배지가 굳을 가능성이 있으므로 적당한 온도에서 작업할 수 있도록 한다.

B. Competent cell의 제조

박테리아를 형질전환(transformation)시키는 대부분의 방법은 수많은 과학자들이 경험적으로 정리한 것이며 그 기전은 정확히 알려지지 않았다. 현재 실험실에서 competent cell을 제조하는 방법으로 다음과 같은 두가지가 주로 사용된다. 첫번째 방법은 fresh frozen 방법으로 DH1, DH5, MM294등의 E. coli를 높은 효율(5 ×108 transformed colonies/μg of supercoiled DNA)로 형질전환시킬 수 있으며, strain에 따라서 효율이 떨어지기도 하지만 사실상 거의 모든 경우에 사용할 수 있는 방법이다. 보다 간단한 방법인 두번째 방법은 calcium chloride를 이용하며 대략 107 transformed colonies/μg of supercoiled DNA의 효율을 가지고 있다.

1) Fresh 또는 frozen 방법을 이용한 competent cell의 제조

이 방법은 Hanahan(1983)에 의해 개발된 방법으로 DH1, DH5, MM294등의 strain을 높은 효율로 형질전환할 수 있다. 다른 strain에서는 약 5～10배 정도 효율이 떨어지고, MC1061 등은 이 방법으로 형질전환이 되지 않는다. 분주하여 -70°C deep freezer에서 2~3개월간 보관하여도 효율이 별로 감소하지 않는다.

실험방법

1. Agar plate(LB 또는 SOB)에 자란 E.coli DH5α colony를 SOB medium 3 ml(20 mM이 되도록 2 M MgCl2를 30 μl 첨가)에 접종한 후 밤새 키운다. 효율을 증가시키기 위해서는 -70°C deep freezer에 보관한 frozen bacterial stock에서 새로 streak한 plate를 사용하는 것이 좋다.

2. 위에서 자란 균 2 ml를 200 ml의 SOB medium(20 mM이 되도록 2 M MgCl2 를 2 ml 첨가)에 다시 접종한 후 O.D.600이 0.4가 될 때까지 shaking incubator에서 키운다. 보통 약 3～4시간이 소요되며, 약 2시간 이후부터 30분마다 O.D.를 계속 측정해보는 것이 좋다(효율을 증가시키기 위해서 배양된 세균 수가 108 cells/ml를 넘지 않는 것이 좋다). 이론상 E.coli는 최적 조건에서 doubling time이 20분이므로 이에 맞추어 시간을 추정해 볼 수 있으나 배양조건을 고려해야 한다.

3. 배양액을 멸균된 50 ml conical tube 4개에 나누어 넣고 얼음에 10분 방치한다.

4. 4,500 rpm, 4°C에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집은 상태로 약 1분간 놓아둔다.

5. 배양 부피의 1/3(tube당 15 ml) 되는 frozen storage buffer(FSB)에 세포침전물을 부유시킨 다음, 두 tube씩 합쳐서 30 ml 씩으로 만든 후 얼음에 10분 놓아둔다. FSB의 성분은 표 1과 같다.

* 침전된 균을 부유시킬 때 vortex 보다는 pipetting으로 부유시키는 것이 좋은데, 이때 15 ml을 모두 넣고 부유시키려면 잘 되지 않는다. 처음 1~2 ml을 넣고 잘 부유시킨 다음에 15 ml 까지 FSB로 채우고, 잠깐동안 약하게 vortex를 하는 것이 좋은 방법이다.

6. 위와 같이 다시 원심분리한 후 처음 배양 부피의 1/12.5(tube 당 8 ml)되는 FSB에 부유시키고, 두 tube를 합쳐서 16 ml로 만든다.

7. DMSO를 3.5%(V/V)만큼 가한다(560 μl). 이때 DMSO는 세포 부유액의 중앙에 떨어뜨리고 곧바로 tube를 기울이면서 5～10초간 부드럽게 섞도록 한다.

8. 얼음에 5～15분 놓아둔다.

9. 다시 같은 양의 DMSO를 가하여 최종 농도가 7%(V/V)이 되도록 하고, 얼음에 10~15분 둔다.

10. 미리 차게해 둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주한다.

11. 사용할 때까지 -70°C deep freezer에 보관한다. 상온에 나와 한번 녹았던 competent cell은 다시 보관할 경우 효율이 대단히 감소하므로 버려야 한다.

표 1. FSB 제조 (1 liter)

1 M potassium acetate는 90 ml의 순수한 물에 9.82 g의 potassium acetate를 녹인 후, 2 M acetic acid로 pH를 7.5로 맞춘 다음 물을 가하여 최종 부피가 100 ml 되도록 만든다. 만든 용액은 10 ml씩 나누어 -20°C에 보관한다.

* 위의 성분들을 모두 섞어 800 ml의 증류수에 녹인 다음, 0.1 N HCl을 이용하여 pH를 6.4로 맞춘다. 만약 pH가 6.4보다 낮아졌다면 염기를 가하여 다시 맞추지 말고 용액을 버린 다음 다시 처음부터 시작하여야 한다. 마지막으로 증류수로 최종 부피를 1 liter로 만든 다음 0.45-micron pore size filter로 여과하여 멸균된 용기에 담아 4°C에 보관한다.

2) Calcium chloride를 이용한 competent cell의 제조

이 방법은 Cohen등에 의해 개발된 방법을 약간 변형시킨 것으로, 효율은 Hanahan 방법에 비해 떨어지나 간편하고 보통 cloning목적으로 사용하기에는 충분하므로 실험실에서 많이 사용되는 방법이다. 이 방법으로 만든 competent cell은 시간이 오래 지날수록 형질전환 효율이 다소 감소하긴 하지만 -70°C deep freezer에 보관하여 사용할 수 있다.

실험방법

1. LB plate에 자란 DH5α colony를 LB 배지 2 ml에 접종한 후 밤새 키운다.

2. 위에서 키운 배양액 1 ml을 100 ml LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.600 이 0.4가 될 때까지 37°C shaking incubator에서 키운다.

3. 배양액을 50 ml conical tube에 넣고 얼음에 10분간 놓아둔다.

4. 4°C에서 4,500 rpm으로 10분간 원심분리한다.

5. 상층액을 완전히 제거한 후 미리 차게 해 둔 0.1 M filtered CaCl2 용액을 원래의 1/2부피로 넣고 부유시킨다.

6. 얼음에 15분 놓아두었다가 다시 4°C에서 3,000～4,000 rpm으로 10분간 원심분리한다.

7. 상층액을 버리고 처음의 1/10 부피의 filtered CaCl2 용액으로 부유시킨다.

8. 얼음에 30분 놓아두었다가 미리 차게 해둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주하고, 사용할 때까지 deep freezer에 보관한다.

3) Ultra-competent cell의 제조(Inoue method)

최근에 Inoue에 의해 소개된 방법이다(Gene 96: 23-28, 1990). 낮은 온도에서 배양한 균을 쓰는 것이 특징으로, 대단히 높은 효율의 competent cell을 얻을 수 있다.

실험방법

1. Agar plate(LB 또는 SOB)에 자란 E.coli DH5α colony를 LB 또는 SOB medium(10 mM MgCl2와 10 mM MgSO4 함유) 3 ml에 접종한 후 밤새 키운다.

2. 위에서 자란 균 1~2 ml을 250 ml의 SOB medium에 다시 접종한 후 18°C~상온에서 O.D.600이 0.6이 될 때까지 shaking incubator에서 키운다.

* 18°C에서 배양하는 것이 힘들 때가 많기 때문에 상온에서 배양을 하게 되지만, 낮은 온도에서 배양하는 것이 높은 효율의 세포를 얻게 되는 주요 과정이다. 균 농도 보다는 배양 온도에 신경을 쓸 것. 전날 colony 한 개를 접종한 후 overnight으로 배양하면 아침에 대략 이 정도의 균 농도가 된다.

3. 배양액을 멸균된 50 ml conical tube에 나누어 넣고 얼음에 10분 방치한다.

4. 4,500 rpm, 4°C에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 tube를 뒤집은 상태로 약 1분간 놓아둔다.

5. 미리 차게 해 둔 80 ml의 transformation buffer(TB)로 부드럽게 부유시킨 후 얼음에 10분 놓아둔다. TB의 성분은 10 mM PIPES, 55 mM MnCl2, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl이며, pH 6.7로 맞춘 용액이다.

6. 위와 같이 다시 원심분리한 후 20 ml의 TB에 부유시키고 DMSO를 7%(V/V)만큼 가한다. 이때 DMSO는 세포 부유액을 섞으면서 중앙에 천천히 떨어뜨린다. 다 넣은 후에도 5～10초간 부드럽게 섞도록 한다.

7. 얼음에 10분 놓아둔다.

8. 미리 차게해 둔 microfuge tube에 200 μl 씩 분주한다.

9. 사용할 때까지 -70°C deep freezer에 보관한다.

C. 박테리아의 형질전환

박테리아의 형질전환이란 plasmid DNA를 세포 내로 넣어주는 작업을 말한다. 형질전환은 거의 모든 cloning과정에 필수적이므로 가능한 한 효율적인 방법을 찾는 것이 중요하다. Large DNA는 small DNA보다 형질전환 효율이 떨어지며 DNA의 양이 너무 많아도 좋지 않으므로, 같은 competent cell을 사용하더라도 적당한 길이와 적당한 양의 DNA를 사용하는 것이 중요한 요소이다.

실험방법

1. -70°C deep freezer에 200 μl 씩 보관된 competent cell tube 하나를 꺼내어 손바닥에 쥐고 있으면 cell 용액이 녹기 시작한다. Cell 용액이 다 녹으면 곧바로 얼음에 넣어둔다.

2. DNA를 competent cell에 넣고 tube를 4~5번 기울이거나 가볍게 손끝으로 쳐서 부드럽게 섞는다.

* DNA 용액은 competent cell 부피의 5%를 넘지 않는 것이 좋다. 대개 competent cell은 200 μl를 사용하므로 DNA는 10 μl 이하로 조정한다. DNA의 양이 많다고 효율이 점점 증가하지는 않는다.

3. 얼음에 30분 동안 둔다.

4. 42°C 에서 90초간 heat shock을 준다.

5. 얼음에 2～3분 두었다가 LB 또는 SOC 배지 (SOB 배지에 20 mM glucose 함유) 800 μl를 넣고 잘 섞은 후, 37°C 에서 45분간 배양한다. Rock table을 사용하여 흔들어 주는 것도 좋다.

6. 미리 37°C에 두었던 LB (with ampicillin) plate에 위 혼합액을 적당량 pipette으로 떨어뜨린 후, 밀대로 골고루 펴준다.

* LacZ 유전자를 이용한 color selection을 하는 경우, 배지에 isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG)와 X-gal을 첨가해주어야 한다. X-gal(50 mg/ml) 20~40 μl와 IPTG(839 mM) 5~10 μl를 미세원침관에서 섞어 배지위에 떨어뜨리고 밀대로 골고루 펴주면 되는데, 37°C에 적어도 10분 두었다가 박테리아를 도말하도록 한다. X-gal은 50 mg/ml의 농도로 dimethylformamide(DMF)에 녹여 빛이 차단된 용기에 담아 -20°C에 보관하고, IPTG는 2 g을 증류수에 녹여 10 ml 까지 채운다음 0.22 μm-filter하여 1 ml씩 나누어 -20°C에 보관한다.

* 위에서 만들어진 혼합액은 대략 1 ml 정도가 된다. 이 혼합액을 모두 plate에 떨어 뜨리고 밀면 잘 밀리지도 않고 물이 흘러 배양도 잘 되지 않는다. 그러므로 이 혼합액에서 적당량의 액체를 제거하는 방법으로 다음과 같은 방법을 쓴다.

1) 과정 5까지 끝낸 균 용액을 10,000 rpm에서 15초간 원심 분리한다.

2) 상층액을 약 850 μl 정도 버린다.

3) 나머지 150 μl로 침전물을 부유시키고, 이를 plate에 도말한다.

* 대부분의 경우 vector와 insert를 ligation한 DNA로 형질전환할 경우, 위와 같이 하면 colony들이 잘 분리되는 정도로 배양된다. 그러나 self ligation의 경우에는 colony가 너무 많이 생겨 colony들끼리 잘 분리되지 않는다. Double stranded circular DNA를 쓰는 경우에는 더욱 그러하므로, 위 과정을 경험적으로 조금씩 바꾸어 실험해야 할 것이다. 자신이 없는 경우는 균 혼합액을 10 μl, 100 μl, 나머지 용액 이렇게 나누어 도말해 보면 된다.

7. 37°C 배양기에서 plate를 뒤집어서 밤새 배양한다. 12～16시간이면 colony를 관찰할 수 있다.

흡광도를 이용한 세균의 성장곡선 측정

1. 실험 목적

세균을 액체배지에 배양할 때 성장곡선을 측정하기 위하여 평판배지에서 콜로니숫자를 측정하는 콜로니계수법으로 세균의 숫자를 측정한다. 대량 배양할 때나 실험하는 샘플의 숫자가 많은 경우에는 배양액의 흡광도를 측정함으로써 세균의 생장을 측정할 수 있다. 이번 실험에서는 배양액에서 세균의 생장곡선을 흡광도 측정방법으로 조사한다.

2. 실험 원리

이 방법은 세균의 배양액에 일정한 파장의 빛을 통과시켰을 때 용액은 그 빛을 흡수 또는 산란시킬 수 있고 이 때 흡수된 빛의 양은 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 것이다. <그림1>은 흡광도계에서의 빛의 경로를 표시한 것이다. 전구에서 나온 백색광은 회절격자(Diffraction grating)에 의해서 일정한 파장 순서의 스펙트럼으로 배열되므로 파장조절장치를 이용하여 우리가 원하는 단일파장의 빛을 시료에 투사시킬 수 있다. 시료를 투사한 빛은 광전관(Phototube)을 거쳐서 검류계(Galvanometer)에 백분율로 표시할 수 있게 된다. 이때 투과된 빛의 양은 시료의 균체수에 반비례하게 된다. 따라서 여러 가지 비율로 희석된 배양액의 흡광도(Optical Density, OD)를 잰 다음 각 흡광도에서의 정확한 세표수를 알아내어 이들의 상관관계를 구해놓으면 흡광도 측정만으로도 미지의 균체수를 알아낼 수 있다.

3. 실험 재료 및 방법

▣ 재 료

․균주 : Escherichia coli 배양액(6시간 이상 배양)

․배지 : LB broth 배지, LB agar 배지(LB broth 배지에 Agar 15g/ℓ첨가)

․기구 및 시약 :분광 광도계,

무균대, 멸균된 피펫, 멸균된 희석용 시험관, 멸균된 증류수

▣ 과 정

(1) 멸균된 상태의 배지 100㎖에 E. coli 배양액 1㎖을 접종하여 키운다. (37℃, 200 rpm)

(2) 접종 후 4시간동안 0 time을 포함하여 매 30분마다 시료를 무균조작 방법으로 채취하여 다음과 같이 흡광도 측정을 수행한다. 시간별로 시료를 채취하여 흡광도(파장은 595nm 또는 600nm)를 잰다. 0 time에서의 OD600은 0.08～0.1로 출발하는 것이 적당하다. 배양시간에 따른 흡광도의 변화를 그래프용지를 사용하여 그려보고 이로부터 대수기에서의 Generation time을 간접적으로 구해본다. Generation time은 흠광도의 변화가 2배로 될 때까지 걸리는 시간이다.

4. 실험수행상 주의 할 점

(1) 시간별로 시료를 채취할 때 무균조작 하도록 하고 채취가 끝난 배지는 바로 배양 기에 넣어 시간을 지체하지 않도록 한다.

(2) 분광광도계(Spectrophotometer)를 사용할 때는 충분히 예열을 해야 하며 반드시 멸균된 동일 배지로 0점 조정을 한 후 사용한다.

5. 고찰

(1) 배양시간에 따라 세균의 변화를 반대수(Semi-log) 그래프 용지에 그려보고 Generation time(GT)을 직접 구해본다.

GT = t log2/ (logA-logB)

여기서 B = 대수생장기에서 한 시점에서의 세균수

A = 대수생장기에서 두번째 시점에서의 세균수

t = A, B 두 지점사이의 시간

(2) 흡광도 측정 및 콜로니 계수법의 두 가지 방법으로 구한 Generation time을 비교해보고, 또 대수기에서의 흡광도와 균체수의 상관관계를 알아보자. (E. coli에서는 OD600 = 1일때 약 0.8 x 109 cells/ml을 나타낸다.)

세균 수 측정(Bacterial Population Count)

1. 실험의 배경과 목적

일정한 체적의 물질 내에 세균이 얼마나 오염되어 있는가를 알아보는 방법에는 여러 가지가 있다. 예컨대 우유에 오염된 세균수를 알아보려면 일정량의 우유를 슬라이드에 도말하여 현미경으로 직접 세어보거나, 혈구 계산에 흔히 쓰이는 혈구계수기(hemacytometer)로써 세균수를 세어 전체 용적의 세균수를 계산하는 방법도 있다. 그러나 위와 같은 방법은 표본에 세균수가 비교적 적은 경우에 적용하는 방법들인 것이다. 본 실험에서는 폐수, 우유, 식료품 등 어떠한 물질이든 간에 세균수 측정에 흔히 사용하는 두가지 방법에 대하여 자세히 알아 보기로 하자.

2. 실험재료 및 방법

1) 정량 평판법(Quantitative plating Method, Standard Plate Count)

표준 평판법(S.C.P)라고도 하며 그림 1 처럼 일정량의 멸균수를 주입한 희석병에 표본을 일정한 비율로 희석하여 한천배지의 평판에 접종하는 방법이다.

그림 1과 같이 샘플에서 1㎖을 취하여 멸균수 99㎖이 든 희석병 A에 접종하면 표본 원액은 100배로 희석된 셈이다. A 희석병에 1㎖을 정확히 따서 B의 99 ml에 접종하면 10,000배로 희석되며, 그와 같은 방법을 희석병 C에 적용하면 1,000,000배 희석된 셈이다. 그런데 표본 원액에 세균이 얼마나 존재하는지를 알지 못하므로 희석병 B와 C로부터 각각 0.1㎖와 1.0㎖씩 희석된 표본액을 따서 한천배지의 평판에 접종시키게 된다. 왜냐하면 희석병에서는 균체수가 지나치게 희석되므로 인하여 한천평판위에 콜로니를 형성치 못할 경우가 있을 것이며 또 어떤 경우는 희석병 B의 경우에도 균체수가 아직도 너무 많이 존재할 경우도 있을 것이므로 적어도 B와 C의 희석병에서 희석수를 따서 접종함으로써 실험결과를 상호 보완할 수 있을 것이다.

▣ 재 료

E.coli의 액체배양체,

nutrient agar,

멸균된 페트리 접시 다수, 멸균된 피펫 다수,

99㎖의 멸균수를 담은 마개달린 희석병(dilution blank)3개

▣ 과 정

① nutrient agar를 액화하여 50℃ 정도로 식히고 항온수조에 넣고 99㎖의 멸균수가 긴

희석병에 각각 A,B,C로 표시하고, 또한 멸균된 페트리 접시의 밑바닥에

1:10,000 , 1: 100,000 , 1: 1,000,000 및 1:10,000,000으로 표시하여 놓는다.

② E.coli의 배양체를 잘 흔들어 멸균된 1.1㎖피펫으로 1㎖의 세균용액을 따서 희석병에

접종한다.

③ 희석병 A를 마개를 닫은 채로 25회 정도로 흔들어서 균체덩어리를 분리되게 한다.

④ 멸균 피펫으로(1.1㎖)희석병 A에서 1㎖을 취하여 희석병 B에 접종하고 25회 흔들어

준 후 역시 동일한 과정을 거쳐서 희석병 B와 C에 접종한다.

⑤ 희석병 B를 25회 흔들고 멸균 피펫으로 1㎖을 취하여 1:10,000으로 표시한 페트리

접시에 0.1㎖을 취하여 1:100,000으로 표시한 페트리 접시에, 0.1㎖을 취해 1:10,000,000의 페트리 접시에 접종한다.

⑥ 50℃의 nutrient agar 배지를 이미 표시해 놓은 페트리 접시에 주입하고 조심스럽게

흔들어 주어서 배지와 접종 세균이 잘 섞이도록 해 준다.

⑦ 배지가 완전히 굳으면 35℃의 항온기에 페트리 접시를 거꾸로 넣어서 48시간 배양한

다.

*세균수의 측정과 계산

colony counter를 사용하면 측정에 편리하나 이러한 기구가 없으면 마커펜으로 페

트리 접시의 앞 또는 뒷면을 4분원체, 콜로니가 너무 많으면 8분원체로 금을 그어 놓고 해

부 현미경을 통하여 관찰할 수도 있다.

① 48시간 배양한 페트리 접시를 꺼내어 희석된 순서대로 놓고 비교하여 본다. 그리고 나타난 콜로니의 수가 30보다는 많고 300보다는 적은 것이 어느 것인가를 대략 확인해 보라.

30이하 또는 300이상의 콜로니를 가지는 페트리 접시는 세균수 측정에 오류가 생길 가능성이 많다.

② 적당한 페트리 접시를 Quebec콜로니 계수기에 올려 놓고 확대경을 통하여 크고 작은 모든 콜로니를 계수기를 가지고 셈한다.

③ 콜로니의 수를 1㎖당 세균수로 계산한다. 즉, 1:1,000,000배로 희석하여 접종한 페트리 접시에서 220개의 콜로니를 측정했다면,

220 × 1,000,000= 220,000,000 세균/1㎖

으로 계산할 수 있다. 단 2개의 유리수를 사용함이 바람직하다. 예컨대 227 개의 콜로니를 측정했다면 230,000,000 세균/1㎖로 표시하는 것이다.

2) 탁도 측정법(Turbidimeteric Determination)

세균수를 측정해야 할 표본이 과다할 경우에 정량 평판법을 통하여 측정하는 것은

여러 모로 힘든 경우가 많다. 예컨대 수많은 유리 기구라든가, 상당량의 배지, 이에 따르는

세척, 준비 등 시간적으로도 감당하기 어려운 경우가 있으므로 흔히 표본의 세균들을 배양

하여 배양액의 탁도(turbidity)를 측정하는 방법을 택하고 있다. 탁도를 측정하는 것은 흔히

흡광도(spectrophotometer)를 사용하는데 이는 세균배양액 내에서 세균들이 마치 교질용액

의 적은 입자처럼 존재하면서 어느 범위내의 광선을 흡수하는 원리를 응용하고 있다. 즉 세

균 배양액의 농도에 따라서 광흡수는 비례함을 나타내 주고 있다. 그러나 균체의 탁도를 세

균수로 확인하기 위해서는 흔히 표준 평판법을 병행하여 사용하기도 한다.

실험보고서 A. 정량평판법

1. 어느 plate가 측정하기 좋도록 희석이 되었는가?

2. 그 곳에는 어느 정도의 콜로니가 있었는가?

3. 배양시 1㎖당 얼마나 많은 균이 존재했는가?

미생물 배지의 준비

1. 실험 배경과 목적

세균배양에 필요한 배지는 배양하고자하는 미생물의 종류에 따라 적합한 것을 선택하여 사용하여야 한다. 따라서 미생물의 종류에 따라 배지의 제법이 다소 달라질 수 있다. 여기서는 배지를 준비할 때 기본적인 주의점과 멸균법 및 평판배지, 사면배지 준비법을 살펴보고, 세균배양에 가장 많이 쓰이는 영양배지의 제법을 실습하도록 한다.

1) 배양배지의 준비

배지를 만들 때는 그 조성에 따라 필요한 내용물을 저울 등으로 담아 용기에 담고 혼합하여 물을 가한 후 멸균하는데, 세균배양에 필요한 다양한 배지들이 조성대로 이미 만들어져 탈수시킨 상태(dehydracted media)로 시판되는 종류도 많다. 탈수배지는 정해진 농도로 물을 가한 후, 멸균하여 사용하면 된다. 일반적으로 배지를 만들 때는 다음 사항을 지켜야 한다.

① 배지를 담을 유리용기는 가능하면 깨끗한 것으로 경질유리제품 (pyrex)을 이용한다. ② 특별히 언급한 경우가 아니면 증류수를 사용한다.

③ 배지 내용물을 정확히 달아 언급한 순서대로 첨가한다.

배지의 pH는 미생물의 생장 에 의해 변화된다. 따라서 필요할 경우 배지 준비시 pH측정기나 pH 지시종이로 재고 지정한대로 배지의 pH를 맟추도록 한다. 대개의 배지는 그 구성성분이 완충능을 갖도록 되어있으나, 필요한 경우 제조시 산이나 알칼리를 첨가하여 pH를 보정해 주어야 한다.

④ 물에 녹인 배지는 특별히 불용성 물질이 함유된 경우를 제외하고는 맑아야하며, 배지 가 맑아야만 접종 후 균체의 생장여부를 쉽게 판독할 수 있다. 따라서, 배지를 맑게 하기 위해서는 여과지 등으로 직접 여과시키거나, 계란의 흰자(egg white)를 가한 후 가열하면 녹지 않은 입자들이 계란 흰자와 함께 응어리로 뭉쳐지는데, 이를 여과하여 맑게 만들기도 한다. 여과시 배지의 양이 적은 것은 여과지로 (Whatman No. 1) 거르 고, 양이 많을 경우에는 두꺼운 펼프층이나, 목화솜 등을 Buchner funnel에 진공펌프 를 이용하여 여과시키도록 한다. 이런 연후에 구멍크기가 작은 여과지로 걸러 모든 현탁입자를 제거시킨다.

⑤ 배양배지는 멸균 전에 사용하기 편리한 양만큼 솜마개, 금속마개 또는 나선형 뚜껑이 덮힌 시험관이나 플라스크에 나누어 담는다.

2) 배지 멸균시의 일반적인 유의사항

배지는 일반적으로 고압증기멸균기(autoclave)를 사용하여 121℃(101.3kpa 또는 15 p.s.i)에서 15분정도 멸균하나 멸균시간은 용기의 종류나 배지의 양에 따라 다르다. 멸균시간은 정확히 측정하여 결정하도록 한다. 왜냐하면 너무 가열되면 대부분의 배지성분이 손상되기 때문이다. 또한 배지 멸균시 솜마게는 종이나 알루미늄 박으로 싸서 너무 젖지 않도록 하고, 나선형 뚜껑등은 약간 느슨하게 닫아서 가열에 의한 팽창 때문에 깨지지 않도록 하고, 멸균후에 꺼내어 꽉 잠그도록 한다.

열에 약한 배지 (또는 배지 성분)는 여과하거나 변형된 열처리법으로 멸균하되 초기에 배지를 만들 때 오염되지 않도록 무균조작에 신경쓰도록 한다. 주로 열에 약한 성분은 여과하고, 열에 안정한 성분은 별도로 습윤멸균한 후 무균적으로 둘을 섞어 사용한다.

3) 탄수화물의 멸균과정

일반적으로 가능하면 고농도의 용액을 여과하여 사용한다. 탄수화물의 종류에 따라 다음의 방법으로도 멸균가능하다.

① Tydalization : 하루간격으로 3일동안 100℃에서 30분간 끓인다. 주로 adonitol, arabinose, inositol, raffinose, rhamnose, sorbitol, trehalose.

② 35kpa(약 5.2 p.s.i)에서 25분간 습윤멸균 : aesculin, fructose, glucose, glycerol, lactose, mannitol, salicin, sucrose 등

③ 여과법으로만 사용할 것 : inulin, maltose, xylose.

열에 안정한 배지성분은 모두 물에 녹여 따로 습윤멸균한 후, 위와 같이 따로 멸균한 탄수화물을 무균적으로 첨가한다. 이 경우 곧바로 사용하지 말고 37℃에서 하루밤 방치하여 멸균여부를 확인한후 사용하도록 하고, 특정당의 이용하는데 사용하고자 할 때는 그 배지에서 확실히 생장하는 것으로 알려진 표준 균주를 배양했을 대 양성반응이 나타나는지 확인한 후에 사용하도록 함이 현명하다.

④ 보관법 : 나선뚜껑 시험관에 든 배지는 직사광선을 피하여 상온에서 보관한다. 이 용기는 배지의 증발을 방지하여 보관시 배지의 건조를 방지하는 이점이 있다. 솜마개 또는 금속마개를 한 시험관이나 플라스크는 4℃에 보관하도록 한다.

4) 고체 평판 및 사면배지의 준비법

고체배지는 다량준비하여 멸균하고 (미리 멸균하여 둔 것은 사용직전에 고압증기 처리하거나 끓여서 녹이고) 50℃로 식힌 후, 열에 약한 혈액, 항생제, 당, 아미노산등은 역시 45℃정도로 맞추어 첨가하되 거품이 일지 않도록 용기를 조심스럽게 흔들어 혼합한다. 그런 다음 멸균된 페트리 접시나 용기에 나누어 붓는다.

① 페트리접시에 붓는 법 : 멸균된 페트리 접시를 바닥이 평평한 곳에 준비해 두고 45～50℃로 식힌 배지가 든 플라스크의 입구를 불꽃으로 살균한 다음, 페트리접시의 뚜껑을 열고 15㎖ 정도씩 붓는다. 이때 오염이 되지 않도록 주의하고 배지를 부은 페트리접시는 배지가 굳을 때까지 움직이지 않도록 한다. 굳은 고체 평판배지는 비닐막 등으로 잘 싸서 4℃에 보관하도록 하며, 사용 전에 잘 말려서 사용하도록 한다. 한천배지의 표면에 물기가 있으면 콜로니가 명확히 구분되지 않게 되어 단일 콜로니의 선별이 어렵다. 4℃에서 며칠간 보관한 경우는 건조시간이 단축되거나, 따로 건조시킬 필요가 없는데, 필요할 경우 37℃에서 하룻밤 방치하여 배지를 말리도록 한다. 이 과정은 건조와 동시에 배지의 오염여부를 확인할 수 있는 장점이 있다.

② 사면배지 준비법 : 물에 녹인 배지를 중탕하여 잘 녹인 후 약 5㎖씩 (시험관의 크기에 따라 양을 조절한다) 나누어 담고 마개한 후, 습윤멸균한다. 멸균이 끝난 후 배지를 비스듬히 기울여(30-40도 정도) 굳힌다. 이 때 사면배지가 너무 경사지거나 배지량이 많아서 시험관 입구 가까이에 도달하지 않도록 주의한다. 대개 시험관의 ½정도로 한다. 필요에 따라 접종침을 찔러 접종할 경우에는 약 7㎖의 배지를 붓고 바로 세워서 굳히도록 한다. 사면배지 역시 4℃에서 보관하도록 한다.

2. 실험 재료 및 방법

▣ 재 료

한천(agar), 효모추출물(yeast extract), tryptone, NaCl,

2ℓ짜리 삼각플라스크 혹은 비이커,

500㎖짜리 삼각플라스크, 500㎖짜리 눈금 실린더,

솜, 마개,

pH측정기, 저울, 1N HCl, 1N NaOH, 멸균기

시약용 숟갈, 유산지, 증류수가 들어 있는 비이커 (또는 세척병)

▣ 과 정

① 2ℓ플라스크에 증류수 500㎖을 붓는다.

② tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g 을 플라스크에 달아 넣는다. 이때 유산지 를 천칭위에 올려놓고, 증류수로 잘 씻은 시약용 숟갈을 휴지로 닦아 물기를 완전히 제거하여, 시약을 달도록 한다. 한 시약을 달고 난 후 에는 숟갈을 꼭 세척하도록 하 며, 부주의하여 시약통의 시약이 다른 시약에 의해 오염되지 않도록 주의한다. 또한 천칭에 시약을 흘리지 않도록 주의하며, 흘린 경우에는 즉시 닦아내도록 한다.

③ 플라스크를 잘 흔들어 내용물을 다 녹인다. 증류수를 가하여 전체량이 1ℓ가 되도록 한다.

④ 위 용액을 500㎖ 플라스크에 250㎖씩 나누어 담고 다음과 같이 한다. 첫 번째 배지에는 더 이상 배지성분을 첨가하지 않고 액체배지로 사용하고, 두 번째 배지에는 한천 3.75g (고체배지를 만들 때는 한천을 배지 1 리터당 15g을 첨가)을 가하고 흔들 어준 다음, 5분쯤후에 중탕하여 녹이되, 가끔 흔들어 준다. 이렇게 만든 것이 영양한 천배지이다.

⑤ 위의 네 가지 배지를 pH측정기(또는 pH 측정용종이)로 1N HCl이나 1N NaOH를 가 하여 pH 7.0 으로 맞춘다. 사용 후 pH 전극(electrode)은 잘 세척한다.

⑥ 시험관에 각각 나누어 담고 마개를 한 후 습윤멸균을 121℃(15 p.s.i)에서 15～20분 멸균한다.

⑦ 멸균이 끝나면 사면배지 만들어 놓은 것은 기울여 눕혀 사면배지를 만들고, 식혀서 4℃에 보관한다.

3. 실험수행상 주의 할 점

영양배지 등 영양소가 풍부한 배지에 포도당을 첨가할 때는 일반적으로 다른 배지성분과 함께 녹여 습윤멸균 하기도하며, 멸균시간을 10분 내외로 단축하기도 한다. 그러나 생장율 측정또는 생리적 특성 조사용 배지를 만들 때는 앞서 살펴본 바와 같이 여과하여 멸균한 높은 농도의 포도당 저장용액을 만들어두고 50℃정도로 식힌 배지에 첨가하도록 한다.

Resurrecting the extinct

res·ur·rect          부활시키다, 되살리다, 파내다 [rèzərékt]

Through this process, they were able to resurrect all different types of dinosaurs

res·ur·rec·tion       (죽은 사람의) 되살아남, 부활.

They view the policy as a resurrection of 'individual university admission exam'

ex·tinct            [종족·가계·생물 등이] 멸종한, 사멸한 an extinct animal

ex·tinc·tion          (종족·생물의) 절멸, 멸종

im·ag·ine           상상하다 / …을 꾀하다 / 생각하다

gi·ant              엄청나게 큰, 거대한

stuff               ① 재료 ② 물건 ③ 물질 

leg·end            전설, 구전(口傳); (현대의) 전설적 인물; [불] 민간 전승

mam·moth         [고대 생물] 매머드: 플라이스토세(世)의 거대한 코끼리.

mas·to·dont       ＝mastodon 마스토돈:제3기 중기의 구치에 유두(乳頭)상 돌기가 있는 장비목(長鼻目)의 포유 동물.

ground sloth      **나무늘보  gigantic extinct terrestrial sloth-like mammal

of the Pliocene and Pleistocene in America

sáber-toothed cát    (고생대의) 검치호(劍齒虎): 화석(化石) 동물.
spe·cies [spíːʃiːz]     [생물] 종(種) (생물 분류의 기본 단위 cf. FAMILY

van·ish      [보이던 것이] [특히 갑자기 시야에서] 사라지다, 보이지 않게 되다 [from ‥]

 [지금까지 존재하던 것이] (어느덧, 수수께끼같이) 없어지다, 소실되다;

vanish from[out of] sight -cf. DISAPPEAR

part·ly             부분적으로, 일부분은; 어느 정도는, 얼마간은, 다소는

ex·pan·sion        [불] 확장, 확대, 증대, 팽창, 신장, 발전, 전개; 상술(詳述), 증보

re·port             […을] 알리다, 보고하다; report＋doing […이라고] 알리다,

re·mark·a·ble        […의 점에서] 범상치 않은, 예외적인, 진기한[for, about ‥]

주목할 만한, 눈에 띄는 (conspicuous), 현저한(striking)

ad·vance             […의] 진보, 향상, 발달[of, in, on ‥]; 승진, 승급, 출세

pos·si·bil·i·ty         […의] 가능성, 실현성, 가망[of, for ‥, that절]

daz·zle                   [강렬한 빛이] …의 눈을 어지럽게 / 부시게 하다 [-의 훌륭함·아름다움 등이] …의 판단을 흐리게/란 시키다, 압도 …을 감탄하게 하다, 현혹시키다

- The lights of the car dazzled me. / He dazzled her with his talk of a luxurious future

wool·ly             털(모양의 것)이 있는; [식물] 부드러운 털에 덮인.

im·ag·i·na·tion      상상, 공상; 상상력, (특히 문학상) 창조[창작]력, 창의; 천재 cf. FANCY [유의어]

rè-creátion            ① 개조 ② 재현 ③ 개조물  / (오락·놀이 등에 의한) 레크리에이션, 기분 전환

fílm·màker       영화 제작자, 영화 회사

DNA             [생화학] ＝deoxyribonucleic acid.

crea·ture         생명이 있는 것, 생물; 동물, 축생; (주로 미) 가축, (소)말

ul·ti·mate·ly       최후로, 마침내, 결국      = finally , in the end , at last , at long last

He thought seriously of quitting, but ultimately decided to stay on.

se·quence        [불] 연속 [잇달아] 일어나기; (연속적 일어나는) 순서, 차례

the sequence of events / in chronological sequence / in sequence

se·quenc·ing      (격식) (연속하는 것의) 배열, 순서.

-       Sequencing clearly is an associative operation, here equivalent to function composition

-       Genetic sequencing of healthy and infected samples allowed scientists to isolate and compare the bacteria, viruses and fungi present in honeybees

ge·net·ic         [생물] 유전(학)의; 유전 인자의[에 의한] / 발생[기원]의, 발생론적인.

blúe·prìnt        청사진; (비유) 상세한 계획[윤곽] / [생물] (유기 생명체의) 청사진.

a blueprint for the new plan

/ make[draw up] a blueprint for the future

code            ① 법전 ② 암호, 기호 (체계), 약호 (체계); (암호의) 문자, 단어, 숫자 ③ 부호 

re·cent·ly        요즈음, 최근에, 조금 전; 새로이

ma·chine        기계; 기계 장치(※작고 단순한 것은 instrument)      

 - the economic machine

(사회·생물체의 복잡한) 기구(機構), 기관         

- Man is a consuming machine

lab·o·ra·to·ry    실험실, 연구,시험소; (약품 등의) 제조소; 사진 현상소; 감식, 과학 수사 연구소

[lǽbərətɔ̀ːri]     - When he got back, there was a strange mold on some of his lab cultures.

mag·ic          마법, 마술, 주술

an·cient           옛날의, 태곳적부터의; 고래(古來)의, 아주 오래된

[éinʃənt]           1. ancient 오랜 옛날에 있었던 또는 시작된. 2. antiquated 구식이라 쓸모없게 된 ◇ antiquated system 구식이 된 제도. 3. antique 오래되어 진기한 ◇ antique chair 옛날 의자. 4. old-fashioned 시대에 뒤진, 구태의연한, 유행에 뒤진

break onto the scene 갑자기 나타나다, 튀어나오다, 혜성처럼 등장하다

-       Hirst broke onto the art scene in 1990 with "A Thousand Years," perhaps his most controversial work.  / Alexander is now concentrating her efforts on breaking onto the scene in America.

har·vest         수확하다, (농작물을) 거둬들이다; …을 채취하다; [목재 등을] 벌채하다

fos·sil              화석(성)의, 화석화한 / 발굴된

mo·lec·u·lar       분자의[에 의한, 로 된], 분자 사이에 존재하는

field                분야, 활동 범위, 영역  - It's outside my field

prog·ress          진행, 진전, 진척 (상태)

stag·ger·ing       비틀거리는 / 깜짝 놀라게 하는, 멍하게 하는; [수량이] 엄청난

-       Imagine receiving a cell phone bill which is staggering

dis·cov·er·y        발견, […이라는] 발견[that절]

hair shaft         모간: 털의, 피부 표면에 노출되어 있는 부분, 모근(毛根)이 아닌 부분

-       Biotin transports fatty acids to the hair to ensure that the follicles and hair shaft are well nourished and moisturized.

shaft               ① 자루 ② 수갱 ③ 화살 

seal                           ＋[목]＋[전치사]＋[명사] …을 […에] 넣고 봉하다, 봉인하다 [in ‥]

plas·tic            플라스틱의 / 플라스틱 / 조형의 / 크레디트[신용] 카드

pro·tect·ing       보호하는

rich                (양적으로) 풍부한, 많은, 충분한

plen·ti·ful         풍부한, 넉넉한, 충분한 / 풍부하게 생기는

source             ① 원천 ② 근원 ③ 출처                                 cf. sauce [sɔːs]

pos·si·bly          ① 아마, …인지도 모르는, 혹시 ② 아무리 해도 ③ 어쩌면

es·pe·cial·ly       특히, 각별히; 두드러지게(markedly); 보통 이상으로

pre·serve          [사람·물건을] [위험·부패 등으로부터] 보호[보존, 보관]하다[from ‥]

pros·pect          (또는 a prospect) [불] […의] 예상, 예기, 기대[of ‥](※expectation보다 약함)
[prάspekt ]        ① 전망 ② 기대 ③ 가망 - in prospect of a good harvest

fo·ren·sic          범죄 과학의, 과학적 범죄 조사의; 법의학적인 / ① 법정의 ② 변론의 ③ 토론의

-       In fact, the process often relies on forensic evidence and eye witness accounts to verify if events really did take place

ma·te·ri·al         재료; 원료; (물건의) 구성 요소, 성분, 소재

prom·is·ing       전도유망한, 가망 있는, 기대할 수 있는 (hopeful)

dust·y              ① 먼지투성이의 ② 먼지를 뒤집어쓴 먼지가 자욱한 ③ 칙칙한, 잿빛이도는

spec·i·men        견본, 실례 cf. EXAMPLE/ (생물학상의) 표본, 시료, 시험품

tuck                …을 [좁은/안전한 곳에] 치워두다, 쑤셔[비틀어, 밀어] 넣다, 감추다[up, away]

 (보통 수동태) [건물을] 남의 눈에 띄지 않는 곳에 짓다[away]

tucked             걷어[집어] 넣은, 집어넣고 꿰맨; (구어·방언) 가두어넣은, 좁다란

tréasure tròve    매장물: 소유자 불명의 매장 보화 / 귀중한 발견(물) / (지식·예술품 등의) 보고

-       This is a bit misleading though, because the site is a real treasure trove

Trove              ① 귀중한 수집품 ② 귀중한 발견 ③ 발견물 = treasure trove

clump             [사람·물건의] 집단, […의] 덩어리[of ‥] / […의] 숲, 덤불, 풀숲[of ‥]

frag·ment         (물건의) 파편, 조각; 단편

ge·nome          [유전학]생물의 생활 기능 유지를 위한 최소한의 유전자군을 함유하는 염색체의 한 세트.

de·code            [암호 등을] 번역[해독]하다(↔encode);

génetic engineering       유전자 공학. = gene-splicing , recombinant DNA technology

dif·fer              […과; …간에] 다르다[from ‥; between ‥]; al·ter               …을 바꾸다, 고치다; …을 […로] 바꾸다[into ‥]

 (alter부분적/ change전면적 변경)

Cf. al·tar ① 제단 ② 성찬대 ③ 제단자리

clon·ing           미수정란의 핵을 체세포 핵으로 바꾸어 유전적 동일 체를 얻는 기술/ 복제하는

ad·van·tage       ① 이점 ② 유리한 점 ③ 이익 

per·ma·frost        (북극 지방의) 영구 동토층.

[pə́ːrməfrɔ̀st]     - According to Field, a major problem caused by global warming is the melting of the arctic permafrost.   /   The permafrost also contains methane, which is 25 times stronger than carbon dioxide

con·ven·ient·ly      ① 편리하게 ② 마침, 형편이 좋게도 ③ 형편 좋게 

fro·zen               ① 동결된 ② 냉담한 ③ 추위로 언

tis·sue               [생물] 조직

in·tact                (서술적) 손상되지 않은, 온전한, 원래대로의

/ 변하지 않은; 영향을 받지 않은

 / [몸이] 완전[건전]한; 젊고 싱싱한; 처녀의

-       It was buried in sand and rocks that helped keep the skeleton intact. / There is also no metal strong or light enough in order to stay intact in space.

trans·fer             ① 갈아타다 ② 옮기다 ③ 전근

nu·cle·us            [생물] 핵, 세포핵                                                               [njúːklias]

cell                   [생물] 세포; (동식물 조직 내의) 작은 공동(空洞)

egg                  [생물] 난자(卵子)(ovum, egg cell).

súrrogate mother  대리모: 다른 부부를 위하여 자궁을 빌려주고 아기를 낳는 여성

sur·ro·gate          대리(인), 대행자; (일반적으로) […의] 대용물[for, of ‥]; 대리모

[sə́ːrəgèit]      - The United States already tolerates markets for blood, semen, human eggs, and surrogate wombs.     /     Professional brokers are advertising, giving infertile couple the possibility of having a surrogate-born child

-       Surrogate mothers are usually young, healthy females who are able to conceive.  /  The embryo was then implanted into a surrogate mother cow.   /  The transgenic embryos were then implanted in the uterus of seven surrogate mother marmosets.

interspecies          [생물] (이)종 사이의, 이종간의

= in·ter·spe·cif·ic     [생물] (이)종 사이의, 이종간의

-       Zanjani's sheep is the latest contribution to the controversial field of interspecies cloning.       /        In interspecific hybridisations, however, the inheritance of plastids appears to be more erratic.

im·plant           vt. [의학] [장기·피부 등을] 이식하다; [인공 장기 등을] 끼워넣다.

vi. [생물] [배(胚)·수정란이] (자궁에) 착상하다.

pay a visit to ..  [사람·물건을] 찾아가다, 들르다(※뚜렷한 목적으로 잠깐 방문시) seem               […에게] (…처럼) 보이다, 생각되다, (…)인 듯하다[to ‥]

Ser·en·get·I        [sèrəngéti] 탄자니아 북서부의 초원;

야생동물 보호구(Serengeti Natl. Park) 포함.

fa·cil·i·ty           (보통 -ties) 설비, 시설, 기관; 편의, 편익, 편

in·sti·tute          [ínstətjùːt] 학회, 협회, 연구 기관; 그 건물, 회관

qui·et·ly            조용히, 말없이, 가만히 / 평온하게 / 얌전하게

preg·nan·cy       임신; 임신 기간.,= maternity

ges·ta·tion        임신; 잉태 기간; (병의) 잠복기(gestation period). = maternity

[dʒestéiʃən]       - A typical human gestation is nine months.  /  The different gestation periods are one of the important variations between mammals

e·mer·gen·cy      긴급[비상] 사태, 돌발 사건, 긴급한 경우; 응급 환자 접수처[병실]

wíld·lìfe           (집합적) 야생 생물(야수·야금·야생 식물 등)

en·dan·gered     위험에 빠진; [동식물이] 절멸 위기에 처한 ( <-> non-endangered)

rel·a·tive           동류(同類), 동족 ① 친척 ② 상대적인 ③ 관계가 있는

lap·a·ro·scope     [lǽpərəskòup] [의학] 복강경(腹腔鏡).       

lap·a·ros·co·py    [lӕpərάskəpi] 복강경 검사법; 복강경 수술.

 *lap·a·ro- (연결형) 「배」 「옆구리」

 *-scope「…보는 기계」 「…경」 「…검사기」

laparoscopically 복강경 검사로

or·di·nar·y         보통의, 통상의, 일상적인(customary); 평범한(commonplace) hóuse càt         집고양이, 기르는 고양이

lit·er·al·ly          글자 뜻대로, 엄밀한 의미로, 과장 없이, 정확[충실]히flu·o·resce         형광 현상을 나타내다, 형광을 발하다

[flùərés]            - When excited by a specific wavelength of light, the protein will fluoresce

Fluorescing       형광을 발하는

flu·o·res·cer        형광제(螢光劑), 형광료(螢光料).

pro·ce·dure       [일 처리의] 순서, 절차, 방법, 방식[for‥]; (순서로서 낱낱) 행위, 과정de·pos·it          …을 [어떤 장소에] (특히 주의 깊고 정확하게) 놓다, 내리다gath·er            …을 끌어 모으다[together, in, up]; 하나하나 줍다

/주워 모으다; 정보를 수집하다

do·mes·tic        가정의, 세대의, 가족의

/ [동물 등이] 사람에게 길들여진, 가정에서 사육하는

e·lec·tri·cal        전기의[에 의한]; 뇌성(雷聲)이 울려 퍼지는

pulse              [전기] 펄스: 전압·전류 등의 순간적인 변동.

em·bry·o           씨눈, 배(胚); (보통 임신 8주까지의) 태아. cf. FETUS.

term               임신 기간; 출산 예정일; 해산, 분만

                      - be close to term 출산 예정일이 임박한

 / a term baby 달이 차서 태어난 아기

wíld·càt            살쾡이, (집고양이가 야생화한) 들고양이

óff·sprìng         (사람·동물의) 자식; 자손; (짐승의) 새끼

mate               동료가 되다; 결혼하다; [동물이] 짝을 이루다.

al·to·geth·er       전적으로(wholly), 아주, 완전히; (부분 부정) 전혀(…인 것은 아니다)

                     - That's a different matter altogether. / He is not altogether a fool.

(종종 문미에 쓰여) 전체적으로, 전부 합해서

- a debt of 5 dollars altogether.

/ There were only five persons present altogether.

al-together        「전부 합해서」 「완전히」 

all together       「한꺼번에」 「모두 같이」의 뜻

- put one's books all together in a box 상자 하나에 책 전부 넣다

lit·ter              (동물의) 한배의 새끼 - a litter of pigs /  쓰레기 / (환자,부상용) 들것 / 옛날 가마 

de·vel·op          [사람·사물 등이] 발달하다, 발전하다, 성장하다, 자라서 …이 되다

rè·pro·dúce       [생물] …을 생식[번식]시키다

nat·u·ral·ly        ① 당연히 ② 자연스럽게 ③ 물론 

tool                연장 구실을 하는 것, 수단(means)

car·a·cal           [동물] 카라칼: 남서 아시아·중동산의 스라소니. = desert lynx , Lynx caracal

lynx                [동물] 스라소니; 캐나다스라소니; 스라소니의 모피.

e·land              [동물] 일런드: 아프리카산의 대형 영양.

an·te·lope         [동물]영양; [불] 그 가죽. / (미) 가지뿔영양: 북미 서부산.

cous·in            동류(同類), 같은 계통의 것; 등가물(等價物) / 사촌, 종형제, 종자매

bon·go            [동물] 봉고: 열대 아프리카의 영양.

re·mark            (소견으로) […라고] 한마디하다, 촌평하다, 간단히 쓰다; 말하다

(※직접 화법)

re·mark·a·bly     (형용사부사와 함께) 눈에 띄게, 뚜렷하게, 현저하게, 유별나게; 대단히

nerv·ous         ① 신경 과민의 ② 신경의 ③ 신경질의

 (nervous 현재 일, anxious 곧 일어날 일)

mas·ter         [기예·기술 등을] 숙달하다, 터득하다, 마스터하다

keep·er            (英) (귀중품·공공물 등의) 관리[보관]자; 박물[미술, 도서]관장

 ① 지키는 사람 ② 사육자 ③ 감시원 

rep·re·sent        ① …을 나타내다 ② 대표하다 ③ …을 표현하다 ④ 상징하다

store               …을 […에 대비하여] 비축[축적, 저장]하다

can·is·ter          (습기가 차지 않게 차·커피·담배 등을 넣는) 작은 깡통[상자].

liquid nitrogen  액화 질소

rhino               코뿔소 =rhinoceros

vi·a·ble            [태아가] 살아갈 수 있는; [생리·식물] 생육할 수 있는,  생존 가능한 / 실행가능한

[váiəbl]             - He found a viable solution to the problem

Noah's Ark       노아의 방주

ab·so·lute·ly       ① 완전히 ② 절대적으로 ③ 무조건으로 

threat·ened       위협당한 / [야생 동식물이] 절멸의 위기에 직면한, 절멸할지도 모를. [θrétənd]

in·spire            ① 영감을 주다 ② 고무하다 ③ 고무하여 마음이 내키게 하다

in·vest             [시간·정력 등을] […에] 쓰다, 쏟다[in ‥]

①투자하다 ②부여하다 ③…에 갖춰지다 

post·er          ① 포스터 ② 벽보 ③ 포스터를 붙이다 

- During the 1970s and 1980s, hedgehogs(고슴도치) were one of the poster animals for environment activists through Europe

ef·fort             ① 노력 ② 수고 ③ 분투

con·scious         ① 자각하고 있는 ② 의식이 있는 ③ 의식하고 있는 

con·sult            ① 상의, 상담하다 ② 의견을 묻다 ③ 고려에 넣다, 염두에 두다

rein·deer          순록(馴鹿).

herd·er            (소·양 등을) 지키는 사람, 목동, 지키는 사람

pre·vi·ous·ly       미리, 전에 - three weeks previously / I had met her previously

ón·gòing          (보통 한정적) 계속하고 있는, 진행 중인(developing)

 Resurrecting the extinct

It's difficult to imagine that 10,000 years ago, right here in North America, there lived giant animals that are now the stuff of legends - mammoths and mastodons, ground sloths and saber-tooth cats. They, and thousands of other species, have vanished from the Earth. Today, partly due to the expansion of one species - ours - animals are going extinct faster than ever before.

http://www.cbsnews.com/video/watch/?id=7379646n&tag=cbsnewsMainColumnArea.13

The very definition of extinct means forever, but what if that didn't have to be? As Lesley Stahl reported in early 2010, scientists are making remarkable advances that are bringing us closer than ever before to the possibility of a true animal resurrection.

Who wouldn't be dazzled by an animal like the woolly mammoth, or the sabretooth tiger, the Irish elk or the giant sloth? Today they exist just as bones in museums, alive only in our imaginations and the recreations of artists and filmmakers. But what if that could change?

In the age of DNA, we now know that these vanished creatures, like all life on Earth, are ultimately nothing more than sequences of the four letters - A, C, T, and G - that make up the genetic blueprint or code of life. The codes for extinct animals were thought to have died along with them, until recently, when machines like one at the Smithsonian's DNA lab started working magic.

"Just the study of ancient DNA only broke onto the scene 20 years ago or so. The idea that we could harvest DNA from extinct creatures, from fossil bones, learn something about the past," Sean Carroll, a professor of molecular biology and genetics at the University of Wisconsin, told Stahl.

Carroll says that like so many things in the field of DNA, the progress has been staggering.

One surprising discovery has been the value of ancient hair. Scientists recently discovered that the hair shaft seals DNA inside it like a biological plastic, protecting it, and making hair a rich and plentiful source of genetic information.

"Does that mean that you can take extinct animals, I mean, there's hair in museums? ...And get the genetic sequencing?" Stahl asked.

"Possibly, and especially if those animals were preserved in any way, there's a good prospect of that. It's sort of like 'CSI,' you know? How good is this forensic material? Can you get good DNA information from older and older and older material? That's pretty promising," Carroll replied.

Dusty old specimens that have been tucked away in the drawers of natural history museums like the Smithsonian are suddenly potential treasure troves of genetic information: just a couple of years ago, using only a few clumps of wooly mammoth hair, scientists at Penn State were able to extract enough DNA fragments to figure out most of its genetic sequence, making the woolly mammoth the first extinct animal to have its genome decoded - which raises the question of whether resurrecting one of these creatures is really possible.

Scientists say one option would be genetic engineering: take a living animal that's related to the mammoth, like the elephant, figure out all the places where its DNA differs from the mammoth's, and then alter the elephant's DNA to make it match.

That's not possible just yet, but there may be another way: cloning.

"Is it possible that we're gonna get the full DNA of the woolly mammoth and be able to clone it?" Stahl asked.

"Yes, I think we'll be able to get much, if not all, of the woolly mammoth DNA. And the great advantage there is that a lot of the specimens are in permafrost. So they're sorta been conveniently frozen for us, which preserves DNA, preserves tissue better," Carroll said.

But for cloning, just knowing the DNA sequence from hair isn't enough. You'd need an intact mammoth cell, which Carroll says will be difficult to find, but not impossible.

"It could be a skin cell. It could be any particular cell that hopefully has been preserved well enough, stayed frozen for thousands of years and to transfer the nucleus of that cell into, for example an egg of an elephant," Carroll explained.

He told Stahl that the two species are "close enough" that maybe the elephant could serve as a surrogate mother.

It's called interspecies cloning: implanting DNA from one species into the eggs of another.

Anyone who wants to try it, with a mammoth or anything else, would be well-served to pay a visit to Dr. Betsy Dresser in New Orleans.

Tucked away on 1,200 acres of land that seem part Serengeti, part high-tech medical facility, she and her staff at the Audubon Nature Institute have been working quietly for years on the science and the art of interspecies cloning, and she'll be the first to tell you that, even with living animals, it isn't easy.

"You don't just clone some cells and then all of a sudden you have a baby. I mean, there's so many scientific steps along the way, knowing everything from hormones to the proper surrogate to, you know, length of pregnancy," she explained. "Because, see, we don't know how long a woolly mammoth, the gestation period. We can guess, but we don't know, really."

But Dr. Dresser's work on interspecies cloning is focused on the future, not the past. Rather than trying to resurrect extinct creatures, her goal is to keep the animals we have today from going extinct tomorrow.

"I feel like we're in the emergency room of the wildlife business, really," she told Stahl. "I don't want to see elephants in textbooks or, you know, the way we see dinosaurs. We're going to lose a lot of species if we don't do somethin' about it."

Dresser and her team are trying to increase the populations of endangered animals by putting their DNA into the eggs of their non-endangered relatives.

On the day we visited, they were laparoscopically removing eggs from an ordinary housecat, then sending the eggs down the hall to have the housecat DNA literally sucked out of them.

"What she's doing is she's removing the DNA from this domestic cat egg. And she can see it by what we call fluorescing it," Dresser explained, while observing the procedure with Stahl. "It becomes just very blue, and so now she knows where it is. And now you'll see her go in there and be able to remove it."

Once the housecat DNA is deposited outside of the egg, they will replace it with the DNA of an endangered Arabian sandcat, a completely different species, gathered from a tiny piece of skin.

"And there you see it being inserted into the domestic cat egg," Dresser explained.

"And you made that from just skin?" Stahl asked.

"Just from skin cells, right," Dresser said.

An electrical pulse starts the egg dividing, and if all goes as planned, the now sandcat embryo will be put back into the domestic cat to grow to term.

It has worked before -- with African wildcats; the research has resulted in some interspecies offspring. These interspecies clones were so normal that they even mated the old-fashioned way and produced kittens.

"Eight kittens altogether. We had a couple litters," Dresser told Stahl. "Totally African wildcats, totally healthy. And it said to us, 'Hey this works.' And now that we know we can do it, we can say to the world, 'These animals do develop. They do reproduce naturally.' And we can use this as a tool for endangered species."

Extra: The Tasmanian Tiger

And Dresser is working her way up. Her next interspecies cloning project will use the non-endangered caracal cat as a surrogate mother for an endangered lynx; and after that, the Eland antelope as a surrogate for its endangered cousin, the bongo.

"You know, there are still people who get nervous at the idea of cloning. They think there's something wrong about it," Stahl remarked.

"I'll tell you what, if you have to choose cloning or extinction, I'm gonna choose cloning. But I wanna be darn sure that I know how to do it. And if we don't do it while we have the animals now to be able to learn how to do it, then we're not gonna have a choice. It's not gonna be an option," Dresser said.

So to keep her options open while she's mastering interspecies cloning, she's also putting as many animals as she can on ice, literally.

Dresser is the keeper of a new kind of zoo - a frozen zoo - where she's collecting tiny skin samples from thousands of different animals, representing hundreds of species, and is storing them at 343 degrees below zero in tiny canisters inside tanks filled with liquid nitrogen.

"We've got lions and tigers, we've got gorillas and rhinos. We've got little frogs. All of the animals...that people know in zoos," she explained.

Extra: Frozen Zoo

Asked how long a piece of skin can be viable, Dresser said, "We think these cells can sit here for hundreds, maybe thousands of years."

"So, if any one of these animals were to go extinct, you could bring them back?" Stahl asked.

"In theory, I believe we can," Dresser said.

And she agreed that her frozen zoo is kind of Noah's Ark.

"Do you think we're at the stage where we should be taking every single wild animal, even if they're not endangered, and putting them in a frozen zoo?" Stahl asked.

"Yes. I absolutely do," Dresser said. "What have we got to lose? I think we should put every species in that we can, while we have the opportunity."

Which raises the question: with so many living animals today threatened, why think about resurrecting extinct ones, like the mammoth?

"To bring the woolly mammoth back, we don't have enough space for the big animals we already have," Stahl told Sean Carroll.

"These projects, like the woolly mammoth, they inspire people to think about the meaning of what we're doing here. And why would you invest years and years of your life in trying to bring back a woolly mammoth or taking care of them if you did," he replied.

"That's an excellent question," Stahl said.

"I think it would fire up people's imaginations. And I think somewhere there's a 9-year-old girl watching this program and listening to this saying, 'That's what I wanna do. I wanna bring back these creatures that are extinct. Or I wanna protect creatures that are now threatened from going extinct.' So in many ways, I think the woolly mammoth can sort of be a poster animal for a general effort of being more conscious of our activities on the planet," Carroll explained.

No one has yet found the intact cell it would take to resurrect that poster animal, but in Siberia, four years ago, a reindeer herder discovered a remarkably well-preserved one month old baby mammoth that had lain frozen in permafrost for 40,000 years.

Its DNA was in better shape than any previously found, raising hopes that between new finds and new technology, it may just be a matter of time.

Betsy Dresser stepped down as director of the Audubon Nature Institute recently to work on a book about endangered species and new technology. She continues to consult on the center's work, which is ongoing.

No one knows what causes lifelong face blindness. It was discovered so recently, scientists are just beginning to unravel its secrets. And some of the clues are coming from people who once had normal face recognition, but lost it after suffering damage to part of the brain. And in an interesting twist, those people are also offering insight into the way the rest of us recognize faces. Imagine waking up after a trauma and not being able to recognize the people closest to you -- that's what happened to Colleen Castaldo.

Lesley Stahl: Up until the fall of 2009, did you have any trouble recognizing faces at all?

Colleen Castaldo: No, not at all.

Lesley Stahl: Just like everybody else?

Colleen Castaldo: Like everybody else, yeah.

That all changed late one night when Colleen had a seizure and was rushed to the hospital. Her doctors found a brain tumor and did surgery to remove it, but as she recovered, she started noticing that something wasn't right.

Colleen Castaldo: The nurses. I thought that I was meeting them each for the first time. And then, I would, you know, listen to them and think, I don't know, they were acting like they knew me already.

Lesley Stahl: Oh, disorienting.

She figured it was the medication, until her close friend Doreen came to visit wearing white, and Colleen assumed she was part of the medical staff.

Colleen Castaldo: I looked at her, I smiled and I turned back to my husband and started to talk to him, and he stood up and said, "Doreen." And I looked and thought, "Doreen?" And then, it hit me. I knew right then and there, this is the problem I had been having, that I--

Lesley Stahl: Faces.

Colleen Castaldo: I just-- yeah, faces.

Now even faces she knew well before...

Colleen Castaldo: [George Clooney] No.

Lesley Stahl: OK, well that's George Clooney.

Colleen Castaldo: Oh, wow. No, I wouldn't know that.

...are a mystery to her.

Colleen Castaldo: No, I don't know who that is. Who is it?

Lesley Stahl: The president.

Brad Duchaine showed me an MRI scan of Colleen's brain.

Lesley Stahl: Is that a hole in her brain?

Brad Duchaine: That's right. It's in the right temporal lobe.

Lesley Stahl: So back here.

Brad Duchaine That's right.

And the location of that hole where the tumor had been was a clue. If removing that area caused the loss of face recognition, could that be where all our brains process faces? It turns out that neuroscientists have been trying to figure out how it is that our brains recognize faces for decades.

Nancy Kanwisher: Face recognition is a very difficult problem, because all faces are basically the same.

MIT neuroscientist Nancy Kanwisher...

Nancy Kanwisher: There are these two roundish things here. There's this thing there. There's this thing there. They're all the same. And so discriminating one face from another is a very computationally difficult thing, because it's those subtle differences in the same basic structure that distinguish one thing from another.

And it is exactly those subtle differences face blind people like Jo Livingston miss.

Jo Livingston: I could describe anything I can put into words. Eye color, general overall shape, whether your ears stick out. But those things would bring it down perhaps from the population of the world to a few million.

So she could say this person has dark eyes, high cheekbones, an oval face, which would allow Jo to distinguish her from this person, but this face and this face? Impossible.

Jo Livingston: I can say what I can see. But I cannot say the micro-measurements that are what tell a normal person that it's you and not somebody of the same specification.

But how is it that the rest of us can perceive these two people as distinct individuals despite the similarities? An important clue comes from what we can't distinguish: as we saw earlier, faces upside down. Like these two Duchaine showed me, which look very similar.

Brad Duchaine: Maybe you don't even see that there's any difference.

Lesley Stahl: I see something different in the lower lip.

Brad Duchaine: Yeah.

Lesley Stahl: Eyes are a little different.

Brad Duchaine: But then, if I show them to you upright, so here's the one that you saw on the left there. Looks perfectly normal. And then--

Lesley Stahl: Oh!

Brad Duchaine: Here's the one you saw on the right, you saw upside-down.

Lesley Stahl: Oh my goodness.

The eyes and mouth in the photo on the right had been turned upside-down.

Brad Duchaine: And now the face looks really grotesque.

Lesley Stahl: Wow.

Brad Duchaine: But--

Lesley Stahl: But upside-down--

Brad Duchaine: Upside-down it's really hard to see that.

Nancy Kanwisher: If you look at a face upside-down, you're very bad at recognizing it. If you look at a word or an object or a scene, you can recognize it fine upside-down.

Lesley Stahl: So what did that tell you?

Nancy Kanwisher: It tells you that there's something very special about face recognition. It works in a very different way from recognition of everything else.

And that got Kanwisher wondering if there might be a part of the brain responsible just for seeing faces. She started putting people with normal face recognition into MRI scanners and watching what happens in their brains as they look at different images.

Lesley Stahl: This is what she's seeing?

Nancy Kanwisher: Yeah. This is what she's seeing.

Lesley Stahl: She's seeing faces.

Nancy Kanwisher: Exactly. And now she's seeing objects because we want to know not just what parts of the brain are active when you see faces, but what parts are more active when you see faces than when you see objects.

Kanwisher discovered that there was indeed a place in the brain that becomes very active when we look at faces.

Nancy Kanwisher: In every subject, boom, there was this nice, big response there. It was very exciting.

And it was right in the same area where Colleen's tumor had been. It's called the fusiform face area. So could that be what's missing in people with lifelong face blindness, like Jacob Hodes? Kanwisher put him in the scanner to find out.

Nancy Kanwisher: I really did not expect to see a fusiform face area.

Lesley Stahl: So you thought there'd be nothing there. Like as if instead of having a bullet go through it, he was just born without it.

Nancy Kanwisher: That's right. That's right.

Lesley Stahl: And?

Nancy Kanwisher: And we looked at the data and his face area was beautiful. It's textbook.

She scanned Jo, Ben and Meg as well, and they had fusiform face areas too.

Lesley Stahl: So what does that say to you?

Nancy Kanwisher: It tells us that the problem is not that this thing doesn't exist. There it is. But see, that's the fun of science. It's fun to be told you're just completely and totally wrong because now you have to go back and, you know, think anew.

And one thing she and other researchers are thinking about is a phenomenon as mystifying as face blindness -- its polar opposite - super-recognizers like Jennifer Jarett, who say they recognize almost every face they have ever seen.

Lesley Stahl: Waiters?

Jennifer Jarett: Yes.

Lesley Stahl: Salespeople?

Jennifer Jarett: Yes. Yes.

Lesley Stahl: Oh, like, of course.

Jennifer Jarett: Yes, absolutely. Yes. I'll be walking down the street and I'll see someone, and I'll think, "Oh retail." And then I'll remember, "Oh OK. That person works at-- as-- whatever store and that's where I s-- or they used to work at that store 10 years ago." And then I remember.

Lesley Stahl: 10 years ago?

Jennifer Jarett: Yes, yes.

Lesley Stahl: So they're-- it doesn't matter how far back you saw these people?

Jennifer Jarett: Yes, yes.

Lesley Stahl: So as long as you look at a person and take notice, they're in there?

Jennifer Jarett: I don't even know how to get rid of people.

Only a handful of super-recognizers have been discovered so far, and Duchaine and his colleagues had to come up with a whole new way to test them.

Brad Duchaine: So here are three faces here, which you're familiar with.

Lesley Stahl: I am?

It's called the "before they were famous test" because super-recognizers can also recognize faces as they change through time.

Brad Duchaine: Does that help at all?

Lesley Stahl: You sure I know that person?

Brad Duchaine: That's Dick Cheney.

Lesley Stahl: Oh my god. That's Dick Cheney?

He told me the top right was Richard Gere, and the bottom, Nancy Pelosi.

Lesley Stahl: Wow. Those three people have changed dramatically.

He even gave me a hint with this one: he's now an actor.

Lesley Stahl: And I'm supposed to know this actor?

Clearly, I was not a super-recognizer.

Brad Duchaine: That's George Clooney.

Lesley Stahl: Man. And these super-recognizers just know this?

Brad Duchaine: The supers are really good at recognizing these faces.

Jennifer Jarett: George Clooney.

Lesley Stahl: How could you tell that was George Clooney?

Jennifer Jarett: It just looked like George Clooney to me.

Jennifer Jarett: Oh, Prince Charles. Oh, Madonna. Michael Jordan.

Jennifer Jarett: Oh that's Kato Kaelin.

Lesley Stahl: The O.J. Simpson trial.

Lesley Stahl: Wow, you are good.

But we thought we had finally stumped her with this one. She said she only had a guess.

Jennifer Jarett: If I were to guess I would say Mike Wallace.

Lesley Stahl: That is Mike Wallace.

She recognized Mike Wallace as a 6-year-old!

Lesley Stahl: I don't even understand how you do that. I can't fathom it.

Jennifer Jarett: As people age I guess the aging process somehow in my brain just seems very sort of superficial. And, you know, as if someone gets a haircut you can still recognize them. It's still the same face to me. It's just the adult version.

So why is 60 years like a haircut to her, while face blind people can't recognize someone they just saw? A team of scientists at Harvard has begun scanning the brains of super-recognizers too, to see if they might yield any clues. The science of facial recognition is in its infancy. But new discoveries can't come fast enough for one last person we'd like you to meet --13-year-old Tim McDonough from Boston, who is severely face blind.

Lesley Stahl: Can you describe what it feels like when someone comes up? You know you're supposed to know who they are--

Tim McDonough: I usually just say, you know, "Hi, nice to see ya."

Lesley Stahl: So you sometimes pretend?

Tim McDonough: Yeah.

Lesley Stahl: You fake it?

Tim McDonough: I fake it, yeah.

[Researcher: So you think it's not your mom?

Tim McDonough: Yeah.

Researcher: OK, so that actually was your mom.]

Tim is working with the Harvard team to see if they can help him learn to recognize his mother's face. It's part of a pilot program to see if face blindness might someday be treatable. So far, it's not.

Tim McDonough: I just hope that nobody tries to talk to me because, if they do, they--

Lesley Stahl: They want to talk about something you've done with them, or something.

Tim McDonough: Yeah. And I don't know who they are.

Lesley Stahl: So it must be really hard to make friends.

Tim McDonough: It is, yeah. Takes me a while to make friends.

It turns out making friends can be tricky at both ends of the face recognition spectrum. Super-recognizers can seem like stalkers.

Jennifer Jarett: I would see someone, you know, weeks or months later at a party and people would say, "Oh, do you know each other?" And I'd say, "Yes." And the other person would say, "No." And I'd say, "No, don't you remember the first week of classes? You were walking to English class with someone..." And people would look at me really strangely and sort of uncomfortably, I think, a lot.

Jennifer says she's now learned to take her cues from others, ironically, just as face blind people do...

Jacob Hodes: I'll play this eye contact game where I'll wait. I'm not gonna really look at you, but I'll wait to see if you look at me. And then, "Oh, you look at me. Oh, look-- oh, hi."

Lesley Stahl: So you're always waiting for a cue from them?

Jacob Hodes: Yeah. So I'll hang back a little bit, which I don't wanna do.

Lesley Stahl: In any social situation, are you always a little anxious?

Oliver Sacks: I'm more than a little anxious. And I tend to keep my mouth closed before I make some awful blunder. Of course, another tactic, or strategy, is to smile at everybody.

That's what Chuck Close told us he does.

Chuck Close: You have to be really charming. If you are going to insult them by not remembering them, you just have to be extremely charming so that people don't hold this stuff against you.

Lesley Stahl: Do you feel now that you're missing out on something?

Ben Dubrovsky: Oh yeah.

Meg Novotny: Yeah.

Ben Dubrovsky: Definitely. I notice a loss.

Ben Dubrovsky: I understand someone by an abstraction. I put together a set of information that to me means mother or means Lesley.

Lesley Stahl: But it's not a visualization of a face.

Ben Dubrovsky: And the question, the thing that I wonder next, you know, is how does it affect even things like love?

Lesley Stahl: How does it?

Ben Dubrovsky: When people talk about love they say, "I carry the person with me. I carry their image with me." I don't carry their image. Does that mean I experience it differently? And how would I ever know? I don't know.

Jacob Hodes: There's a long tail of stuff that happens that you're missing. Connections you're not making.

Lesley Stahl: Still?

Jacob Hodes: Oh yeah. Yeah, yeah, yeah.

Meg Novotny: At least now we understand why.

Jacob Hodes: Yeah, right.

Meg Novotny: And it's therapeutic, but it doesn't fix it.